Korean Journal of
Veterinary Service

닭대장균증(chicken colibacillosis)은 닭의 대장에 정착하는 대장균 무리에서 혈청형 O78, O1, O2 등의 균체 항원을 가진 닭병원성 대장균(APEC; avin pathogenic E. coli)의 전신감염으로 발생하는 질병이다(Kathayat 등, 2021; Watts와 Wigley, 2024). 특히 O78 혈청형 대장균(APEC O78)은 육계에서 빈번한 폐사를 일으키는 원인체로 작용하며, 국내외 양계산업에 큰 손실을 초래하고 있다(Ewers 등, 2004). APEC O78 대장균은 증식이 일어나는 장관에서는 정상세균(normal flora) 무리처럼 보균되지만, 분변으로 배출되어 오염된 계사 환경에서 공기 전파가 일어나면 호흡기를 통해 전신적인 감염증을 일으키는 특징이 있다(Dho-Moulin과 Fairbrother, 1999). 닭에서 호흡기 감염은 우선 오염된 공기가 기낭으로 흡입되어 기낭염이 발생하게 되고, APEC O78 대장균은 점차 폐와 혈류로 침입할 수 있다(Dziva와 Stevens, 2008). 닭에서 기낭염 또는 폐렴에 이어 속발하는 APEC O78 감염에 의한 균혈증(bateremia)은 특히 육계에서 1주령 신생추의 폐사를 초래하는 급성 패혈증을 야기할 수 있고, 또한 양계산업에서 지속적인 경제적 손실을 초래하는 다양한 전신성 감염 증상을 일으킬 수 있다(Joseph 등, 2023). APEC에 의한 전신성 감염 증상으로는 심낭염(pericarditis), 간포막염(perihepatitis), 복막염(peritonitis) 등의 다발성 장막염이 주로 발생하는데, 주로 육계(broiler chickens)에서 빈번하게 발생한다(Joseph 등, 2023). 산란계에서는 총배설강(cloaca)에 연결된 생식기 점막을 통한 상행성 감염으로 난관염(salpingitis)이 발생할 수 있다(Ozaki 등, 2018).

닭대장균증 발병에 대응하는 가장 효율적인 방제 수단은 효과적인 APEC 감염 방어 백신을 개발하는 것이다. 그동안 자가백신 개념으로 불활화 시킨 사균체(bacterin)를 백신항원으로 사용하기도 하였고(Ebrahimi-Nik 등, 2018), APEC 대장균 유래 외막소포체(OMV; outer membrane vesicle)를 수집하여 실험적인 백신물질로 사용한 예도 보고되었다(Wang 등, 2019). 하지만 이러한 불활화 백신의 경우 항체의존성 면역반응이 유도되나, 생백신에 비해 상대적으로 방어효능이 낮은 것으로 알려져 있다(Sadeyen 등, 2015; Islam과 Rahman, 2023). APEC O78 혈청형의 경우 일반적인 대장균에 비해 조직 침투성과 병원성(virulence)이 높아 생균백신으로 세포성 면역반응이 함께 유도되어야 감염 방어에 더 유효할 것이다. 따라서, APEC 예방용 생백신 개발의 필요성이 대두되어 현재 APEC 생백신이 개발되어 시판되고 있다(Fernandes 등, 2013). 시판 중인 생백신(Poulvac^® E. coli, Zoetis)의 경우 O78 ∆aroA 균주를 이용하여 Spray 백신으로 제품화 한 것이다.

본 연구팀은 (주)코미팜의 지원을 받아 colisepticemia를 일으키는 APEC O78에 의한 감염을 효과적으로 방어할 수 있는 새로운 백신주를 창출하여 수입 백신을 대체할 수 있으면서 동등한 안전성과 효능을 가진 생백신 제품을 개발하고자 하였다. 이러한 신규 백신 개발 전략을 바탕으로 초생추에 적용할 수 있는 충분한 안전성과 함께 기존 백신과 동등한 방어효능을 나타낼 수 있는 생백신 후보주를 창출하려는 것이다. 본 연구에서는 기존 백신에서 이용한 APEC aroA 유전자가 타겟이 아닌, Pst (Phosphate transporter) 유전자를 타겟으로 하는 mutant 개발을 시도하였다. 대장균에서 Pst의 기능은 인산 흡수 및 재활용에 관여하는 일종의 house-keeping 기능을 수행하므로(Crépin 등, 2008; Vuppada 등, 2018), 이 pst 유전자의 작용을 억제하면 APEC의 virulence가 현저히 낮아져 약독화 생백신으로 이용할 수 있을 것으로 판단하였다. 우선, 본 논문에서는 APEC O78 pst mutant를 제작하는 실험적 접근 방법 및 생백신 후보주의 안전성을 평가하는 embryo lethality test 수행 결과를 바탕으로 생백신 후보주의 안전성을 확인하였다.

연구에 사용한 O78 혈청형 APEC 야외주(wild-type)는 국내에서 분리한 균주이며, 이를 모체(parental strain)로 삼아 유전자 재조합 방법으로 pst mutant를 제작하였다. APEC O78 pst mutant 제작을 위한 변이도입 과정은 앞서 보고한 논문과 같이 상동성 유전자 사이에서 allelic exchange를 유도하는 방법(Kim 등, 2004; Smith 등, 2008)으로 suicide vector를 이용한 conjugation으로 APEC O78 ∆pst::kan mutant를 제작하였다. 상동성 allele (∆pst::kan)를 pRE107 suicide vector에 구축한 다음, pir 유전자를 보유한 host strain에서 벡터 플라스미드를 유지시켜, 이를 conjugation donor로 사용하였다. 자살벡터의 경우 일반적인 대장균에서는 plasmid가 복제되지 않고 소실되므로, 자살벡터를 보유한 pir⁺ host (donor strain)와 conjugation 실험에서 recipient로 APEC O78 균주를 사용하면, pRE107 suicide vector에 구축된 mutated allele (∆pst::kan) 부분이 APEC O78 균주 이동하여, transconjugant colony (APEC O78 ∆pst::kan mutant)가 제작될 수 있다. 이러한 transconjugant colony는 LB+Kan (50 μg/mL) agar plate에서 선택(colony selection)하여 변이도입 여부를 확인한다. 즉, pst 유전자를 기준으로 상동성 allele 사이에서 유전자 치환이 일어난 double cross-over 콜로니(kanamycin 내성을 가진 APEC 균주)를 선별하여 원하는 변이(∆pst::kan)가 도입된 APEC O78 pst mutant를 확보하였다(Fig. 1).

Figure 1. Schematic procedure for creation of APEC O78 pst mutant by using allelic exchange recombination event.

Embryo lethality test

생백신 후보주로서 새로 제작된 APEC O78 pst mutant의 안전성 평가를 위하여 SPF 종란을 이용한 embryo lethality test를 실시하였다(Nolan 등, 1992; Wooley 등, 2000). Table 1에서 요약한 실험 계획과 같이 부란기에서 12일 동안 부화시킨 SPF 종란 60개를 4개 그룹으로 나누어 시험하였으며, 그룹 1과 2는 각각 닭대장균 야외주와 백신주의 균액을 100 cfu/0.1 mL로 제조한 다음, 균액 0.1 mL를 종란의 장뇨막강(allantoic cavity)에 접종하였다. 그룹 3과 4의 경우는 대조 실험을 위한 PBS 접종군과 비접종군으로 각각 종란 10개를 대조군으로 시험하였다. 이후, 공시된 모든 종란은 37℃ 부란기에서 7일간 부화시키면서 매일 폐사 여부를 관찰하고 기록하였다. 폐사가 일어난 경우, 장뇨막강 액 및 폐사 태아에서 접종한 APEC 균의 증식과 감염 정도를 파악하기 위하여 장뇨막강 액과 태아의 간 조직에서 접종한 세균을 MacConkey agar에 배양하여 균수를 측정하고 오염 여부를 파악하기 위해 동정하였다.

Table 1 . Chicken embryo lethality test for safety evaluation of APEC O78 pst mutant.

Group of inoculation	No. of embryonated SPF eggs	APEC inoculum (cfu per 0.1 mL)
G-1 APEC O78 (wild-type)	20	1.0×102
G-2 APEC pst mutant (vaccine candidate)	20	1.0×102
G-3 PBS (sterile) inoculation	10	-
G-4 Non-inoculation Control	10	-

닭에서 colisepticemia를 일으키는 APEC O78 대장균 감염 예방을 위하여 본 연구를 통해 새로운 생백신 후보주를 제작하고, 백신 후보주의 안전성을 평가하기 위하여 embryo lethality test (계태아 치사성 시험)를 실시하였다. 본 연구의 독창성은 기존 시판 중인 생백신주(APEC O78 aroA mutant)와 다른, 대장균에서 인산의 흡수와 재활용에 관여하는 pst 유전자의 기능을 소실시켜 APEC의 virulence를 현저히 낮추도록 약독화 생백신 후보주를 제작한 점이다. 새로운 생백신 후보주로서 APEC O78 pst mutant의 유전적 특성과 주요 표면항원 단백질의 발현 등 표현형적 특성을 파악하였으며, 장기간 계대 배양을 통해 유전체 수준의 염기서열 변화(변이의 안정적 유지 및 virulence gene profile)를 비교 분석하기 위해 후보주의 전장 유전체 분석(whole genome sequencing)을 수행하였다(data not shown). APEC O78 pst mutant의 유전체 염기서열 분석 및 생백신의 유효성 평가 결과는 추후 별도의 논문으로 보고할 예정이다. 우선 생백신 후보주의 안전성을 평가하는 embryo lethality test 결과를 바탕으로 야외주에 비하여 백신주의 감염력과 병원성 감소 정도를 평가하여 생백신으로 APEC O78 pst mutant의 사용 가능성을 제시하고자 하였다.

Table 2의 계태아 치사성 시험 결과를 보면, 그룹 1의 APEC 야외주 접종군의 경우 접종 후 7일간 관찰 결과 65%의 계태아 치사율이 나타났지만, 그룹 2의 생백신 후보주 접종군에서는 접종 후 7일째 1수가 폐사되어, 5%의 폐사율을 보였다. 이러한 치사율의 차이로 보아, 백신주의 계태아 감염력 및 병원성 정도가 야외주와 비교하여 안전한 수준으로 확인되었다. 또한, 시험 종란에서 장뇨막강 액과 계태아 조직에 존재하는 APEC 대장균의 균수를 측정하기 위하여 MacConkey agar에 조직액을 배양하고 분리균을 동정하였다. 예상대로 폐사가 발생하지 않은 대조군(그룹 3 및 4)에서는 종란에서 어떠한 대장균도 분리되지 않았다. 야외주 접종군(그룹 1)의 경우 모든 폐사체의 장뇨막강 액과 태아 조직에서 셀수 없이 많은 대장균이 배양되었다. 하지만, 백신주 접종군(그룹 2)의 경우 유일한 폐사가 접종 후 7일째 나타났으며, 장뇨막강 액에서는 백신주 대장균이 배양되었지만 계태아 조직에서는 백신주의 콜로니가 형성되지 않았다. 또한, 접종 후 7일간 폐사가 일어나지 않았던 생존란을 대상으로 접종한 대장균을 분리하기 위하여 장뇨막강 액과 태아 조직을 각각 배양하였다. 그룹 1에서 야외주를 접종 받은 생존란에서는 장뇨막강 액과 계태아 조직에서 많은 대장균이 배양되었지만, 그룹 2에서 백신주를 접종받은 생존란에서는 장뇨막강 액에서만 백신주 대장균이 배양되었고 계태아 조직에서는 대장균이 분리되지 않았다. 그룹 2에서 백신주를 접종한 후 7일째 한 개체의 폐사가 발생하였지만, 계태아 조직에서는 대장균이 배양되지 않은 이유로는 여러 가능성을 유추해 볼 수 있으나, 야외주의 경우처럼 계태아 조직 내에서 접종균의 증식과 병원성 발현으로 인한 폐사는 아닌 것으로 볼 수 있다. 이러한 생백신주의 안전성 시험 결과를 종합해 보면, 본 연구에서 신규 제작하여 공시한 생백신 후보주는 부화 중인 종란에서 생존, 증식할 수 있지만 계태아 조직으로 침투하여 조직 내에서 생존할 수 있는 능력이 크게 감소한 것으로 평가할 수 있다.

Table 2 . Monitoring results of embryonic death during the lethality test period.

Group of inoculation	No. of dead embryos in the eggs after APEC inoculation							Total death count	Lethality rate
	1-dpi	2-dpi	3-dpi	4-dpi	5-dpi	6-dpi	7-dpi
G-1 APEC O78 (wild type)	1	2	3	3	1	2	1	13/20	65%
G-2 APEC mutant	0	0	0	0	0	0	1	1/20	5%
G-3 PBS inoculation	0	0	0	0	0	0	0	0/10	0
G-4 Non-inoculation control	0	0	0	0	0	0	0	0/10	0

한편, 계태아 치사성 시험에 사용한 각 그룹별로 생존란과 폐사란에서 APEC 감염 계태아의 이상 유무와 병변을 관찰하였고, 부검을 통해 여러 장기에서 병변을 육안으로 확인하였다. 계태아 관찰하고 부검한 결과, APEC 감염 계태아의 간(liver)에서 염증성 병변과 간 종대가 관찰되었다(Fig. 2). 백신주 접종군에서 생존한 계태아의 간에서는 미약한 염증성 병변(Fig. 2C)이 나타났지만, 야외주 접종군에서 폐사된 계태아의 부검 소견에서는 확연하게(대략 2배 이상) 간 종대가 관찰되었다(Fig. 2D).

Figure 2. Autopsy showing the lesion of liver of the embryos on 7-dpi for the lethality test. (A, B) No pathological lesions found in the liver. (C) Mild inflammatory lesions found in the liver. (D) The liver was enlarged (hepatomegaly) 2∼3 times larger than the normal size.

닭에서 colisepticemia를 일으키는 APEC O78 혈청형 대장균의 감염 예방을 위한 연구를 수행하여 새로운 생백신 후보주를 제작하였고, 이의 안전성을 평가하기 위하여 계태아 치사성 시험을 실시하였다. 공시한 생백신 후보주는 부화 중인 종란에서 생존, 증식할 수 있지만 계태아 조직으로 침투하여 조직 내에서 생존할 수 있는 능력이 크게 감소한 것으로 평가할 수 있었다. 이러한 생백신 후보주는 불활화 백신에 비해 방어효능이 우수할 것으로 기대되며, 현재 생백신의 음수 접종으로 계균에 세포성 면역반응과 감염 방어능력을 평가하는 백신의 유효성 평가 시험을 진행하고 있다. APEC O78 혈청형의 경우 일반적인 대장균에 비해 조직 침투성과 병원성 정도(virulence)가 높아 사균체 백신으로 유도되는 항체 의존성 면역반응으로는 방어에 충분하지 못하고, 생균백신으로 세포성 면역반응이 동시에 유도되어야 감염 방어에 더 효과적인 것으로 생각된다. 이러한 APEC 감염의 특수성과 백신의 필요성을 고려해 보았을 때 새롭고 유효한 생백신의 개발은 국내외 양계산업의 지속적인 발전에 기여할 수 있는 중요한 수단이 될 것이다.

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.