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Korean J. Vet. Serv. 2023; 46(4): 303-314

Published online December 30, 2023

https://doi.org/10.7853/kjvs.2023.46.4.303

© The Korean Socitety of Veterinary Service

산란계에서 Chlorhexidine-inactivated Salmonella Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 3가 백신의 효능평가

유영주ㆍ유정희ㆍ허진*

전북대학교 수의과대학 수의공중보건학실

Received: November 28, 2023; Revised: December 5, 2023; Accepted: December 7, 2023

Evaluation of the protective efficacy of trivalent Salmonella inactivated vaccine including Chlorhexidine-inactivated Salmonella Enteritidis, S. Typhimurium and S. Gallinarum in poultry

Yeong Ju Yu , Jeong Hee Yu , Jin Hur *

Department of Veterinary Public Health, College of Veterinary Medicinee, Jeonbuk National University, Iksan 54596, Korea

Correspondence to : Jin Hur
E-mail: hurjin@jbnu.ac.kr
https://orcid.org/0000-0003-2658-0747

Received: November 28, 2023; Revised: December 5, 2023; Accepted: December 7, 2023

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0). which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Protective efficacy of trivalent Salmonella inactivated vaccine containing Chlorhexidine-inactivated S. Enterltidis (SE), S. Typhimurium (ST), and S. Gallinarum (SG) strains, was evaluated in this study. A total of 70 brown nick layers were divided into 7 groups, A to G, containing 10 hens per group. All hens in groups B to D were intramuscularly immunized with approximately 7×108 cells (3×108 cells of SE+1×108 cells of ST+3×108 cells of SG) of the trivalent vaccine in 0.5 mL of PBS. All chickens in groups E to G were injected with sterile PBS. All hens of groups B and E, groups C and F, and groups D and G were orally challenged with approximately 2×109 CFU of wild-type SE, ST, and SG, respectively. Serum IgG titers and CD3+CD4+ T-cells, and CD3+CD8+ T-cells levels of groups B to D significantly higher than those of group A. In addition, all animals in groups A to C, E and F showed no clinical symptoms and survived after the virulent challenges, whereas one chicken in group D died and all chickens in group G died following the challenge. The protection against wild-type SE and ST in liver, spleen, cecum, and cloaca of groups B and C chickens was significant effective as compared with those in groups E and F. These indicate that the trivalent inactivated vaccine can be an effective tool for prevention of Salmonella infections by inducing robustly protective immune responses and cellular immune response in chickens.

Keywords Salmonellosis, Zoonosis, Foultry, Fowl typhoid, Trivalent vaccine

살모넬라 식중독 감염의 가장 흔한 매개체로는 가금류와 계란으로 알려져 있으며, 살모넬라균에 감염된 닭의 난소 및 난관에서 난각이 형성되기 이전에 살모넬라균이 계란 내부에 오염되거나 산란 과정에서 난각에 오염될 수도 있다(Yang 등, 2010). 국내 식중독 발생 양상은 5년간(2017∼2021년) 평균 259회 발생하였으며, 평균 환자 수는 5,276명으로 매년 꾸준히 보고되고 있다. 이중 식중독 발생 환자수는 살모넬라 식중독이 가장 많은 것으로 나타나고 있으며 더욱이 집단 발생되는 식중독에서 살모넬라균으로 인한 경우가 높은 비율을 차지하고 있음이 보고되고 있다(Ministry of Food and Drug Safety, 2022; Jang 등, 2023).

국내에서 유행하는 살모넬라 혈청형은 Salmonella (S.) Enteritidis가 49%로 가장 높은 빈도로 보고되고 있으며, S. Typhimurium과 S. Typhi가 각각 15.8%와 7.9%를 차지하고 있다. 더욱이 S. Enteritidis와 S. Typhimurium이 차지하는 식중독 발생 비율은 64.8%에 달하는 것으로 보고되었다(Kim 등, 2006). S. Enteritidis 혈청형은 아시아에서 38%의 빈도로 분리 보고되고 있으며, 전 세계적으로도 가장 빈도가 높은 혈청형으로 알려져 있다(Galanis 등, 2006). S. Typhimurium은 1997년 이후 S. Enteritidis 다음으로 가장 높은 비율로 검출되는 혈청형으로 알려져 있으며, 세계적으로도 높은 빈도로 분리 보고되고 있어 그 중요도가 높아지고 있다(Kim 등, 2004; Helms 등, 2005).

Salmonella Gallinarum의 경우 가금티푸스의 원인균으로 산란계에서 심한 설사와 폐사가 특징이며 높은 폐사율을 보이는 세균성 전염병으로 한국에서는 1992년 처음 발병이 보고된 이후 전국으로 발생하고 있는바, 이는 가금티푸스에 취약한 갈색란을 생산하는 품종이 국내에서 주로 사육되고 있기 때문으로 보고되고 있다(Woo와 kim, 1998).

국내에서 가금티푸스 예방을 위해 SG9R과 같은 약독화 생균 백신이 사용되고 있는데 생균 백신은 장기간 방어 효과를 나타내고, 국소면역 및 세포 매개성 면역반응을 유도할 수 있다는 점에서 우수하다는 평가를 받고 있다(Lillehoj 등, 2000; Won 등, 2016). 하지만 살모넬라 약독화 생균 백신의 안전성 문제가 지속적으로 제기되고 있다. 그 이유로는 불완전한 백신주가 접종된 숙주에서 증식하는 과정에서 약독화된 병원성 유전자가 복귀되어 병원성을 회복할 가능성 때문이다(Barbezange 등, 2000). 반면 살모넬라 불활화 백신의 경우 살모넬라에 감염된 닭의 분변을 통한 균 배출이 감소됨과 더불어 계란 내 오염을 감소시키는 것으로 보고되었다(Gast 등, 1993; Jawale 등, 2014; Jawale과 Lee, 2016). 또한 불활화 백신은 높은 안전성을 가지고 있으며, 다른 살모넬라 혈청형과 혼합하여 다가백신으로 사용할 수 있는 응용성을 가지고 있다는 점에서 개발 및 상용화되어 판매되고 있다(Clifton-Hadley 등, 2002). 그렇지만 불활화 사균체 백신의 경우 백신을 접종한 대상 동물체 내의 면역반응에 의해 쉽게 제거될 수 있어 항원 발현이 제한적이라는 단점으로 인해 면역보강제(adjuvant)를 필요로 하며(Desin 등, 2013), 주로 체액성 면역을 유도하고 세포 매개성 면역반응 유도 능력은 약독화 생균 백신에 비해 현저히 떨어지는 단점을 지니고 있어 세포 매개성 면역 반응 유도가 반드시 필요한 세포 내 기생 세균 예방에 있어서는 예방 효과에 한계가 있다(Desin 등, 2013).

최근 불활화 사균체 백신임에도 신개념 사균체 백신인 고스트 백신은 세포 내 기생세균 예방에 필수적인 세포 매개성 면역반응을 유도하여 실험동물에서 살모넬라 감염을 효과적으로 예방하였다는 연구 결과 보고가 있으며, 살모넬라 사균체에 오일보조제(oil-adjuvant)를 혼합한 불활화 백신을 접종한 산란계에서 내부장기 내 살모넬라 분리율의 감소, 분변 내 살모넬라 배출 빈도 및 균량의 감소 등이 연구되었고(Gast 등, 1992; Barbezange 등, 2000, Jawale 등, 2014), 모계에서 생성된 면역 항체는 계란을 통해 병아리로 이행되어 부화 후 일정 기간 동안 살모넬라 야외 감염에 대한 방어력을 제공하는 것으로 보고되었다(Nicholas 등, 1991; Mailson 등, 2022).

따라서 본 연구에서는 국내에서 유행하고 있는 S. Enteritidis와 최근 그 중요성이 증가하고 있는 S. Typhimurium 및 닭의 폐사를 유발하는 가금 티푸스 원인균인 S. Gallinarum을 Chlorhexidine digluconate solution으로 불활화를 유도하여 3가 살모넬라 불활화 백신을 제조하여 산란계에서 체액성 및 세포 매개성 면역반응 유도 여부와 예방 효과를 평가하였다.

실험에 사용된 균주, 배양조건 및 프라이머

불활화 백신 제작 및 공격 접종 균주 그리고 백신 접종 후 항체역가를 측정하기 위한 ELISA coating을 위한 Outer membrane proteins (OMPs) 추출을 위한 균주는 국내 갈색 산란계에서 분리한 S. Enteritidis의 야생형 독성 분리주인 HJL345, S. Typhimurium의 야생형 독성 분리주인 HJL812, S. Gallinarum의 야생형 독성 분리주인 HJL465를 사용하였다(Table 1). 각 균주는 Luria-Bertani Broth (LB; Becton Dickinson, Sparks, MD, USA) 및 Brilliant green agar (BGA; BD Difco, USA)에 접종되어 37℃에서 배양되었다. 공격 접종 후 부검 시 비장과 간 등으로부터 분리된 균주의 혈청형을 확인하기 위해 사용된 Salmonella 특이 프라이머 및 S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 확인을 위한 특이 프라이머 염기서열은 아래 Table 2에 서술하였다.

Table 1 . Bacterial strains used for this study

StrainDescriptionSource of reference
S. EnteritidisHJL345Isolates from Korean chicken in 2009Lab stock
S. TyphimuriumHJL812Isolates from Korean chicken in 2019Lab stock
S. GallinarumHJL465Isolates from Korean chicken in 2016Lab stock


Table 2 . Primer sequences and sizes of PCR-amplified targets

PrimerSequence (5’-3’)Amplification targetAmplification length (bp)Reference
OMPCFATC GCT GAC TTA TGC AAT CGSalmonella genus204Alvarez et al. (2004)
OMPCRCGG GTT GCG TTA TAG GTC TG
ENTFTGT GTT TTA TCT GAT GCA AGA GGSalmonella Enteritidis304Alvarez et al. (2004)
ENTRTGA ACT ACG TTC GTT CTT CTG G
TYPHFTTG TTC ACT TTT TAC CCC TGA ASalmonella Typhimurium401Alvarez et al. (2004)
TYPHRCCC TGA CAG CCG TTA GAT ATT
SG-LGAT CTG CTG CCA GCT CAASalmonella Gallinarum252Kang et al. (2011)
SG-RGCG CCC TTT TCA AAA CAT A
SGP-LCGG TGT ACT GCC CGC TAT172
SGP-RCTG GGC ATT GAC GCA AA


실험 동물

살모넬라에 음성인 농장의 갈색 산란계 초생추 70수를 구입하여 실험에 사용하였다. 연구용 병아리는 실험에 사용된 백신 외에 어떠한 백신도 접종하지 않았으며, 시판 상업용 사료와 음료를 자유롭게 섭취할 수 있는 환경에서 사육되었다. 본 실험에서 보고된 동물실험은 Korean Council on Animal Care의 인가를 받은 전북대학교 동물윤리 위원회의 승인(JBNU2022-066)을 받아 진행하였다.

3가 살모넬라 불활화 백신 제조

3가 살모넬라 불활화 백신의 제작을 위해 Moon 등(2020)의 방법을 약간 변형하여 HJL345 (S. Enteritidis), HJL812 (S. Typhimurium), HJL465 (S. Gallinarum)를 Chlorhexidine digluconate solution (CHX; Merck KGaA, Darmstadt, Germany)으로 불활화를 유도하여 3가 살모넬라 불활화 백신을 제조하였다. 즉, 완전 불활화가 확인된 침전물을 ISA78 adjuvant (Seppic, Seoul, South Korea)와 3:7 비율로 혼합하여, 불활화 전 생균수 기준으로 S. Enteritidis 3×108+S. Typhimurium 1×108+S. Gallinarum 3×108의 균수로 총 7×108 cells/0.5 mL 농도로 혼합된 3가 살모넬라 불활화 백신으로 제조하여 4℃에 보관하며 실험에 사용하였다.

백신 접종 및 가검물 채취

사육된 갈색 산란계가 5주령이 되었을 때 무작위로 선별하여 7그룹(각 그룹 당 10수)으로 나누어 새로운 환경에 적응하도록 일주일간의 안정화 기간을 거친 후 6주령이 되었을 때 음성대조군 그룹 A는 아무 것도 접종하지 않았으며, 백신군인 B, C, D 그룹의 모든 닭은 살모넬라 3가 불활화 백신을 0.5 mL씩 6주령에 1차, 9주령에 2차로 근육 접종하였고, 각 균주별 양성대조군인 E, F, G 그룹의 경우 같은 시기에 각각 멸균 Phosphate-buffered saline (PBS) 0.5 mL씩 접종하였다(Table 3).

Table 3 . Animal experimental group design for trivalent vaccine experiment

GroupnTypes of vaccinesChallenge strain
ANegative control10--
BVaccination10Trivalent vaccineS. Enteritidis
CVaccination10Trivalent vaccineS. Typhimurium
DVaccination10Trivalent vaccineS. Gallinarum
ESE positive cont.10PBSS. Enteritidis
FST positive cont.10PBSS. Typhimurium
GSG positive cont.10PBSS. Gallinarum
Total70


혈청은 0 weeks post prime immunization (1차 접종 전, 0 WPPI), 3 WPPI (2차 접종 전), 6 WPPI (공격접종 전)에 각각 채혈하여 준비하였다. 즉, 채취한 혈액은 3,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 혈청을 분리하였고, 분리된 혈청은 −20℃에 보관하여 실험에 사용하였다.

안전성 확인을 위한 체중 측정 및 상태 관찰

실험에 사용한 백신의 안전성을 평가하기 위하여 백신군과 대조군 모두 백신 접종 전, 1차 접종 3주 후, 2차 접종 3주 후에 닭 체중 측정 개체관리기(GI-1000, G-Tech International, Uijeongbu, Korea)를 사용하여 모든 개체의 체중을 측정하였고, 모든 개체는 하루에 두 번씩 발열, 설사, 식욕부진, 운동성 저하 및 폐사 여부를 확인하였다.

면역반응 평가를 위한 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

3가 살모넬라 불활화 백신 접종 후 S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum에 대한 혈청 immunoglobulinG (IgG) 항체 역가는 각 균주의 OMPs를 추출하여, 간접 효소면역 흡착 측정법(Indirect Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 각 S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum의 OMPs를 멸균 PBS로 0.2 µL/mL이 되도록 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 1%의 Skim milk (Becton Dickinson, Sparks, MD, USA)로 30분간 실온에서 blocking 한 후 WPPI 0, 3, 6에 분리한 혈청을 1:200으로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. Horseradish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-chicken IgG (Bethyl Lab Inc., Montgomery, TX, USA)로 1시간 반응시킨 후 o-phenylendiamine dihydrochloride substrate (Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA)으로 15분간 발색시킨 다음 stop solution (Sulfuric Acid, DUKSAN, Seoul, South Korea)으로 발색을 정지시켜 ELISA 분광도기계(Multiskan Go, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)에서 492 nm 파장으로 optical density (OD) 값을 측정하였다.

세포 매개성 면역반응 측정

세포 매개성 면역 반응 유도 여부를 확인하기 위해 Senevirathne 등(2021)의 방법을 약간 변형하여 Flow Cytometry Analysis에 의해 CD3+CD4+, CD3+CD8+ T-cells이 측정되었다. 즉, 살모넬라 불활화 3가 백신 접종 후 닭의 말초 혈액 내 CD3+CD4+, CD3+CD8+ T-cells 수치를 측정하기 위해 2차 백신 접종 후 2주째에 대조군인 A그룹에서 10수, 백신군인 B, C, D 그룹에서 무작위로 10수를 선별하여 채혈하였다. 1×106/well이 되도록 희석된 말초혈액 내 림프구는 각 300 ng/mL의 S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum OMPs으로 42℃, 5% CO2 조건에서 12시간 각각 재 자극 되었다. 재 자극된 세포는 anti-chicken CD3 Monoclonal Antibody (APC), anti-chicken CD4 Monoclonal Antibody (FITC), anti-chicken CD8 alpha Monoclonal Antibody (PE); (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 4℃에서 30분 동안 형광 염색한 후 BD Accuri™ C6 Plus Flow Cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T-cells 세포군의 분화 정도를 측정하였다. CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T-cells 세포군의 분화 정도는 FlowJo™ Software (BD Difco, USA)를 이용하여 분석되었다.

공격접종 및 생존률과 각 조직에서의 공격접종 균주 분리

국내 갈색 산란계에서 분리한 HJL345, HJL812, HJL465를 LB Broth 10 mL에 각각 접종하여 37℃ 배양기에서 16시간 배양하였다. 배양액을 신선한 LB Broth에서 재접종하여 OD600의 값이 0.6이 될 때까지 배양하였다. 배양액을 4,000 rpm으로 50분간 원심분리하여 상층액을 버리고 침전물을 PBS로 2회 세척하였다. 침전물을 10% sucrose (JUNSEI, Chuno-ku, Tokyo, Japan) 함유 PBS로 각 1×1010 CFU/mL이 되도록 재부유하여, 그룹 B, E의 닭 1수 당 S. Enteritidis를 200 µL씩, 그룹 C, F의 닭 1수 당 S. Typhimurium을 200 µL씩, 그룹 D, G의 닭 1수 당 S. Gallinarum를 200 µL씩 각각 경구접종하였다. 공격접종 후 14일 동안 하루에 두 번씩 설사, 식욕부진, 운동성 저하 및 폐사 여부를 관찰하고, 14일째 모든 생존개체를 희생시켜 간, 비장, 맹장, 총배설강 등으로부터 가검물을 채취하여 Nandre 등(2011)이 기술한 방법에 따라 각 살모넬라 균주를 분리하였으며, 분리된 균주는 Table 2에 기술된 특이 살모넬라 혈청형별 감별 프라이머를 사용하여 공격접종 균주 여부를 확인하였다.

통계분석

모든 실험 결과는 5.02 GraphPad software (San Diego, CA, USA)을 이용하여 Tukey’s multiple comparison test에 기반한 one-way analysis of variance (ANOVA)에 의해 평균 비교되었다. P의 값이 0.05 이하일 때 통계학적으로 유의성이 있다고 평가되었으며, 모든 결과는 평균±표준편차(mean±SD)로 표시되었다.

백신접종 후 안전성

1차 접종 후 3주 동안 체중 변화는 Fig. 1에서 보는 바와 같았다. 즉, 대조군은 1차 접종 후 3주 동안 평균 293.5±47.2 g 증가하였으며, 백신 접종군인 B∼D 산란계는 각각 243.5±40.7 g, 264.5±77.0 g, 245.0±101.8 g씩 증가하였다. 그리고 2차 접종 후 3주 동안 대조군이 304.5±118.5 g 증가하는 동안 백신 접종군인 B∼D 산란계는 각각 258.0±39.9 g, 236.5±94.0 g, 253.0±146.1 g씩 증가하였다. 하지만 PBS 접종 군인 E∼G 산란계는 대조군과 별반 차이가 없었다. 백신 접종군인 B∼D 및 PBS 접종군인 E∼G의 산란계 모두 1차 백신 접종 후 3주간 및 2차 백신 접종 후 3주간 발열, 설사, 식욕부진, 운동성 저하 및 폐사가 관찰되지 않았다.

Fig. 1.Body weight gain post prime and boost immunization with the trivalent Salmonella inactivated vaccine or sterile PBS in chicken. Group A hens were non-immunized; groups B∼D hens were immunized with 7×108 cells/0.5 mL (S. Enteritidis 3×108+S. Typhimurium 1×108+S. Gallinarum 3×108) of the trivalent Salmonella inactivated vaccine, respectively; and groups E∼G hens were immunized with sterile PBS, respectively. Data shown are the means for all hens in each group, and error bars show the standard deviations (SD).

항체 역가

백신 접종 전, 백신 1차 접종 후, 2차 접종 후에 각각 정기적으로 채혈하여 각 살모넬라 OMPs를 이용한 ELISA로 혈청 IgG 항체 역가를 측정한 결과는 Fig. 2와 같았다. S. Enteritidis OMPs로 ELISA를 측정한 결과, 음성대조군인 A 그룹의 접종 전, 1차 접종 후, 2차 접종 후 항체 역가는 각 0.425±0.11, 0.509±0.18, 0.490±0.09로 측정되었고, 백신 접종군인 B∼D 그룹의 경우 접종 전은 각 0.491±0.11, 0.368±0.09, 0.480±0.10으로 음성대조군인 A 그룹과 비슷한 정도의 역가가 측정되었으나 1차 접종 후에는 1.227±0.07, 1.249±0.05, 1.269±0.11으로, 2차 접종 후에는 2.446±0.09, 2.450±0.11, 2.544±0.17로 점차 증가하였다. S. Typhimurium OMPs로 ELISA를 측정한 결과, 음성대조군인 A 그룹의 접종 전, 1차 접종 후, 2차 접종 후 항체역가는 각각 0.377±0.09, 0.462±0.16, 0.599±0.17인 반면 백신군인 B∼D 그룹에서 접종 전보다 1차 접종 후 각 1.634±0.12, 1.623±0.13, 1.654±0.15, 2차 접종 후 각 1.720±0.07, 1.709±0.07, 1.746±0.10으로 항체 역가가 상승하였다. 또한 S. Gallinarum OMPs로 ELISA를 측정한 결과, 음성대조군인 A그룹의 접종 전, 1차 접종 후, 2차 접종 후 항체 역가는 각각 0.514۪.15, 0.477۪.08, 0.576۪.27이었으며, 백신접종군인 B∼D 그룹에서 항체 역가는 1차 접종 후 1.668۪.18, 1.662۪.17, 1.671۪.12으로, 2차 접종 후 2.098۪.05, 2.063۪.08, 2.072۪.09으로 증가하였다. PBS 접종군인 E∼G 그룹은 S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum의 OMPs에 대해 접종 전, 1차 접종 후, 2차 접종 후 음성대조군과 비슷한 항체역가 관찰되었다.

Fig. 2.Serum IgG titers against Salmonella Enteritidis OMPs (A), S. Typhimurium OMPs (B), and S. Gallinarum OMPs (C), respectively, in hens intramuscularly immunized with the trivalent Salmonella inactivated vaccine or sterile PBS. Group A hens were non-immunized; groups B∼D hens were immunized with 7×108 cells/0.5 mL (S. Enteritidis 3×108+S. Typhimurium 1×108+S. Gallinarum 3×108) of the trivalent Salmonella inactivated vaccine, respectively; and groups E∼G hens were immunized with sterile PBS, respectively. Data shown are the means for all hens in each group, and error bars show the standard deviations (SD). Asterisks indicate a significant difference between the values of the groups immunized with the vaccine candidate (*P<0.05) and those of the control group.

CD3+CD4+ T-cells, CD3+CD8+ T-cells

음성대조군인 A그룹과 백신 접종 그룹인 B∼D 그룹의 혈액에서 분리된 림프구를 각 S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum OMPs로 재 자극하고 CD3+CD4+ T-cells, CD3+CD8+ T-cells의 수치를 측정한 결과, 대조군에서의 CD3+CD4+ T-cells 백분율이 각각 16.28%±1.78, 17.22%±1.32, 18.4%±0.68인 반면, 백신 접종군에서의 CD3+CD4+ T-cells 백분율은 22.02%±2.01, 26.16%±1.3, 25.42±13.79로 측정되었다. 각 살모넬라 OMPs로 자극된 CD3+CD8+ T-cells 백분율은 음성대조군의 경우에는 각각 7.8%±1.45, 7.02%±1.03, 8.67%±0.77인 반면, 백신 접종군에서의 CD3+CD8+ T-cells 백분율은 11.24%±1.06, 9.86%±1.11, 12.56%±0.53로 측정되었다(Fig. 3).

Fig. 3.T-cell immune responses. T-cell responses were evaluated by flow cytometry analysis of CD3+CD4+ and CD3+CD8+ cell populations using PBMC collected two weeks post the boost immunization. Cells were stimulated with S. Enteritidis (SE) OMPs, S. Typhimurium (ST) OMPs, and S. Gallinarum (SG) OMPs, respectively. (A) CD3+CD4+ T-lymphocytes population in immunized and nonimmunized chickens. (B) CD3+CD8+ Tlymphocytes population in immunized and non-immunized chickens. Values are shown as mean±standard deviation of 10 chickens per group.

공격접종 후 생존율 및 부검 결과

2차 백신 접종 후 3주째에 음성대조군인 A 그룹을 제외한 모든 그룹에 병원성 살모넬라 균주를 각 200 mL씩 경구접종 하였다. 즉, B, E 그룹에 S. Enteritidis, C, F 그룹에 S. Typhimurium, D, G 그룹에 S. Gallinarum을 마리 당 최종 공격접종 농도가 각 2×109 CFU/0.2 mL이 되게 하였고, 이후 14일간 폐사율을 확인하였다. 그 결과 Fig. 4에서 보는 바와 같이 음성대조군인 A 그룹 및 B, D, E, F 그룹은 10마리 중 10마리 모두 생존하였고, 백신 접종 후 S. Gallinarum을 공격접종한 D 그룹의 경우 공격접종 12일 차에 1수 폐사하여 부검일인 14일차까지 9수 모두 생존하였다. 하지만 S. Gallinarum을 공격접종 한 G 그룹의 경우 공격접종 9일차에 1마리, 10일차에 1마리, 11일차에 1마리, 12일차에 2마리, 13일차에 2마리, 14일차에 3마리가 각각 폐사하여 10마리 모두 폐사하였다(Fig. 4).

Fig. 4.Survival rates after challenge with wild-type virulent S. Enteritidis, S. Typhimurium, or S. Gallinarum in all chickens of group B∼G at 6 WPPI. Group A hens were non-immunized; groups B∼D hens were immunized with 7×108 cells/0.5 mL (S. Enteritidis 3×108+S. Typhimurium 1×108+S. Gallinarum 3×108) of the trivalent Salmonella inactivated vaccine, respectively; and groups E∼G hens were immunized with sterile PBS, respectively. All hens in groups B and E, C and F, and D and G were challenged with S. Enteritidis, S. Typhimurium, and S. Gallinarum, respectively.

균분리 결과

부검 후 균분리 결과 음성대조군인 A 그룹에서는 직접도말 했을 때와 증균배양 했을 때 모두 균분리를 시도한 모든 조직에서 S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum이 검출되지 않았다. S. Enteritidis를 접종한 그룹인 B, E 그룹의 비장, 맹장, 총배설강에서 S. Enteritidis가 분리되었으나 직접도말 했을 때와 증균배양 했을 때 모두 백신접종군인 B 그룹은 PBS 접종군인 E 그룹에 비해 적은 개체에서 S. Enteritidis가 분리되었고, 두 경우 모두 간에서는 분리되지 않았다. S. Typhimurium을 공격접종한 그룹인 C와 F 그룹의 각 조직에서도 S. Typhimurium이 검출되었으나 백신 접종군인 C 그룹에서의 검출 두수가 PBS 접종군인 F그룹에 비해 더 적은 개체에서 균이 분리되었다. S. Gallinarum을 공격접종한 PBS 접종군인 G 그룹에서 모든 개체가 폐사하여 균분리가 시도되지 못했고, 백신 접종 그룹인 D 그룹에서는 1마리가 폐사하여 총 9수를 부검하여 균분리를 진행한 결과 간, 비장, 맹장, 총배설강에서 S. Gallinarum이 각각 분리되었다(Table 4).

Table 4 . Recovery of challenge strain from internal organs of the survived chickens

Group/OrgansChallenge strainn**Direct culture (%)Enrichment culture (%)
LiverSpleenCecumCloacaLiverSpleenCecumCloaca
A-*1000000000
BS. Enteritidis1005 (50)1 (10)2 (20)050 (50)2 (20)2 (20)
CS. Typhimurium1003 (30)2 (20)0040 (4)30 (3)3 (30)
DS. Gallinarum95 (55.6)5 (55.6)2 (22.2)1 (11.1)6 (66.7)5 (55.6)3 (33.3)1 (11.1)
ES. Enteritidis1009 (90)6 (60)4 (40)010 (100)8 (80)8 (80)
FS. Typhimurium101 (10)4 (40)6 (60)7 (70)3 (30)8 (80)7 (70)8 (80)
GS. Gallinarum0--------

All chickens in groups B and E, C and F, and D and G were orally challenged with 2×109 CFU/0.2 mL of S. Enteritidis, S. Typhimurium, and S. Gallinarum, respectively, at 6 WPPI. All the chickens were euthanized at 14 days after-challenge. Statistical analysis carried out with Mann–Whitney U test. Group A hens were non-immunized; groups B∼D hens were immunized with 7×108 cells/0.5 mL (S. Enteritidis 3×108+S. Typhimurium 1×108+S. Gallinarum 3×108) of the trivalent Salmonella inactivated vaccine, respectively; and groups E∼G hens were immunized with sterile PBS, respectively.

*Non-challenged.

**This represents the number of chickens that survived to 14 days after challenge and were necropsied.


닭에서 살모넬라균 배출 감소는 계란과 계육에서 살모넬라균 오염을 감소시킬 뿐만 아니라, 이는 살모넬라로 인한 사람 식중독 발생의 감소로 이어질 수 있다(Garmory 등, 2002). 따라서 닭에서 살모넬라 예방을 하기 위해 약독화 생균 백신과 불활화 사균백신이 상용화되어 사용되고 있지만, 일반적으로 살모넬라균은 세포 내 기생세균으로 세포성 면역 반응을 유도할 수 있는 약독화 생균백신이 불활화 백신에 비해 방어 효과가 더 우수하다고 알려져 있다(Desin 등, 2013). 그러나 약독화 생균백신의 안전성에 대한 문제가 주기적으로 제기되고 있어(Kang 등, 2009), 약독화 생균백신을 대체할 불활화 백신에 대한 요구가 증가하고 있는 추세이다. 불활화 백신에 의해 생성되는 항체는 주로 IgG이며, 주로 체액성 면역을 유도한다(Muotiala 등 1989; Gast 등, 1993). 최근 신개념 불활화 사균체가 마우스 및 가금에서 세포성 면역 반응을 유도하여 살모넬라를 효과적으로 예방하였다는 연구 결과 보고(Won 등, 2018; Moon 등, 2020; Senevirathne 등, 2021; Senevirathne 등, 2022)를 접할 수 있었다. 더욱이 불활화 백신은 여러 살모넬라 혈청형을 혼합하여 동시에 여러 혈청형을 동시에 예방할 수 있는 다가백신으로 사용할 수 있는 장점을 가지고 있다(Clifton-Hadley 등, 2002).

이에 본 연구에서 Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 함유 3가 불활화 사균체 백신으로서의 가능성을 평가하기 위해, Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 불활화 사균체를 오일보조제와 혼합하여 갈색 산란계를 대상으로 근육 접종하여 면역반응 유도 및 방어효과를 평가하였다. 우선 살모넬라 3가 불활화 사균체 혼합백신을 근육 접종한 후 발열, 설사, 식욕부진, 운동성 저하 및 체중 감소와 폐사 등과 같은 임상 증상을 관찰한 결과, 백신 접종된 산란계에서 통계학적으로 유의미한 체중 저하가 관찰되지 않았고, 다른 임상 증상 또한 관찰되지 않아 살모넬라 3가 불활화 백신의 안전성이 확인되었다. 이 결과는 Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 3가 백신이 산란계에서 근육으로 접종하는 백신 후보물질로서 안전하게 사용할 수 있음을 보여주는 결과였다.

혈액 내 높은 수준의 체액성 면역반응 유도는 감염된 동물이 세포 내 기생세균의 전신 감염을 방어하는데 매우 중요하다(Mastroeni 등, 2001; Alvarez 등, 2004; Kim 등, 2019; Moon 등, 2020). 이들 혈액 IgG 항체는 옵소닌 작용을 통해 감염된 동물에서 식세포의 작용을 극대화함으로써 혈액으로부터 병원성 세균을 제거하는데 있어 중요한 역할을 수행한다(Mittrücker 등, 2000; Mastroeni 등, 2001; Kim 등, 2019). 따라서 본 연구에서 살모넬라 불활화 3가 백신을 갈색 산란계에 근육접종한 후 채취한 혈청에서 각 S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum의 OMPs에 대한 특이 혈청 IgG 항체 역가를 측정하였다. 그 결과 각 S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum의 OMPs에 대한 항체 역가는 백신 접종 후 대조군 그룹 A는 접종 전과 비슷한데 반해, 그룹 B∼D의 항체 역가는 3WPPI 째에 점차적으로 증가되기 시작하여 6WPPI에는 대조군 그룹 A에 비해 모두 유의성 있는 항체 역가 증가가 관찰되었다(P<0.05). 하지만 PBS를 접종한 그룹 E∼G의 항체역가는 대조군과 별반 차이가 없었다. 이상의 결과는 Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 3가 백신을 갈색 산란계에 근육 접종하였을 경우 각 항원의 간섭작용 없이 각 항원별로 면역 항체를 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.

세포 내 기생세균인 살모넬라의 완벽한 제거를 위해서는 높은 체액성 면역반응 유도뿐 아니라 세포 매개 면역반응 유도는 반드시 필요하다(Norimatsu 등, 2004; Feng 등, 2005; Roesler 등, 2006; Brumme 등, 2007; Pascual 등, 2002; Hur 등, 2011; Moon 등, 2020). CD4+ 및 CD8+ T-cells는 살모넬라 제거를 위한 획득면역 형성에 특히 중요한 것으로 보고되고 있다(Nauciel 등, 1990; Mittrucker 등, 2000). CD4+ T-cells은 IFN-γ와 TNF-α와 같은 대식세포 활성화 사이토카인 생산 또는 유도를 통해 살모넬라 감염을 제어하는 것으로 알려져 있다(McSorley 등, 2000). 또한 CD4+ T-cells은 항체를 생산하는 B-cell을 지원하고 살모넬라 특이 CD8+ T-cells의 생성에 도움을 주는 것으로 알려져 있다(Mittrucker 등, 2000). CD8+ T-cells은 감염된 세포의 용해를 유도함으로써 살모넬라가 식세포나 다른 자연살해세포 등에 노출될 수 있도록 하고, 식세포를 불러 모으고 활성화에 필요한 사이토카인을 생성한다(Stenger 등, 1998; Mittrücker 등, 2002). Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 3가 백신을 근육 접종한 후 측정한 말초혈액 내 CD3+CD4+ T-cells과 CD3+CD8+ T-cells은 대조군에 비해 유의성 있는 유도가 확인되었다. 이상의 결과로 Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 백신을 근육 접종 할 경우 불활화 사균체 백신임에도 불구하고 체액성 면역 반응뿐만 아니라 세포 매개 면역 반응을 유도할 수 있음이 확인되었다.

Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 3가 백신을 접종한 그룹에서는 병원성 S. Enteritidis를 공격접종 했을 때 증균 배양을 통한 균 분리 시 맹장과 총배설강에서 각 20%, 비장에서 50%의 비율로 공격접종 균주인 S. Enteritidis가 각각 분리된 반면, PBS를 접종하고 병원성 S. Enteritidis로 공격접종 한 경우에는 최소 80%의 비율로 분리되었다. 더불어 병원성 S. Typhimurium을 경구로 공격접종 한 경우, 면역화된 그룹에서는 맹장과 총배설강에서 각 30%, 비장에서 40%의 비율로 공격접종 균주가 분리된 반면, PBS를 접종하고 공격접종 한 경우에는 최소 70%의 비율로 분리되었고, 더불어 백신 접종군에서는 분리되지 않았던 간에서도 30%의 개체에서 공격접종 균주가 분리되었다. 또한 병원성 S. Gallinarum을 경구로 공격접종 하였을 경우, 면역화된 그룹에서는 공격접종 후 12일째에 1수에서 폐사가 관찰되어 90%의 생존율이 관찰되었지만, PBS를 접종한 그룹에서는 공격접종 7일째부터 식욕 부진 및 운동 실조 등이 관찰되었고, 9일째부터 폐사가 시작되어 14일째 모두 폐사하여 폐사율이 100%로 관찰되었다. 이를 통해 Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 3가 백신이 각 병원성 살모넬라에 대해 높은 면역 반응을 유도를 통해 높은 방어 효과가 있음을 확인하였다. 하지만 보다 완벽한 방어를 위해서는 각 살모넬라 불활화 사균체의 혼합 비율 및 접종량 변경 그리고 기존 판매되고 있는 SG9R과 연계된 접종 프로그램 최적화 실험 등 추가 연구가 필요하다고 사료된다.

본 연구는 사람에게서 식중독을 일으키는 주요 원인균인 살모넬라를 예방하기 위해서 살모넬라 3가 불활화 백신을 제조하여 체액성 및 세포성 면역 반응 유도와 공격접종 균주에 대한 방어효과를 평가하였다. S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 혈청형을 Chlorhexidine을 이용하여 불활화 시키고 오일보조제와 혼합하여, Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 3가 백신을 제작하여 산란계에 2회 근육으로 예방 백신을 접종 시킨 결과, 각 항원이 서로 간섭 작용을 하지 않고 체액성 및 세포성 면역반응을 효과적으로 유도함을 확인하였다. 더불어 살모넬라 3가 불활화 백신을 2회 접종 후 각 병원성 S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 균주로 공격접종 하여 각 균주에 대한 방어 여부를 확인해 본 결과, 각 병원성 균주를 효과적으로 방어하는 것이 확인되었다. 이상의 결과를 종합해 보면, 살모넬라 3가 불활화 백신을 근육접종을 통해 백신접종할 경우 갈색 산란계에서 살모넬라 감염을 효과적으로 방어할 수 있음이 확인되었다. 하지만 공격접종 후 보다 완벽한 예방 효과를 위해서는 각 살모넬라 불활화 사균체의 백신 제조 시 혼합 비율 및 접종량의 조절 그리고 약독화 생균 백신인 SG9R과 연계한 백신접종 프로그램 최적화 등 추가 연구가 필요하다고 생각된다.

이 논문은 정부의 재원으로 농림식품기술기획평가원(Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture and Forestry, IPET)의 지원을 받아 연구되었습니다(No. 122007-2).

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

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Article

Original Article

Korean J. Vet. Serv. 2023; 46(4): 303-314

Published online December 30, 2023 https://doi.org/10.7853/kjvs.2023.46.4.303

Copyright © The Korean Socitety of Veterinary Service.

산란계에서 Chlorhexidine-inactivated Salmonella Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 3가 백신의 효능평가

유영주ㆍ유정희ㆍ허진*

전북대학교 수의과대학 수의공중보건학실

Received: November 28, 2023; Revised: December 5, 2023; Accepted: December 7, 2023

Evaluation of the protective efficacy of trivalent Salmonella inactivated vaccine including Chlorhexidine-inactivated Salmonella Enteritidis, S. Typhimurium and S. Gallinarum in poultry

Yeong Ju Yu , Jeong Hee Yu , Jin Hur *

Department of Veterinary Public Health, College of Veterinary Medicinee, Jeonbuk National University, Iksan 54596, Korea

Correspondence to:Jin Hur
E-mail: hurjin@jbnu.ac.kr
https://orcid.org/0000-0003-2658-0747

Received: November 28, 2023; Revised: December 5, 2023; Accepted: December 7, 2023

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0). which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

Protective efficacy of trivalent Salmonella inactivated vaccine containing Chlorhexidine-inactivated S. Enterltidis (SE), S. Typhimurium (ST), and S. Gallinarum (SG) strains, was evaluated in this study. A total of 70 brown nick layers were divided into 7 groups, A to G, containing 10 hens per group. All hens in groups B to D were intramuscularly immunized with approximately 7×108 cells (3×108 cells of SE+1×108 cells of ST+3×108 cells of SG) of the trivalent vaccine in 0.5 mL of PBS. All chickens in groups E to G were injected with sterile PBS. All hens of groups B and E, groups C and F, and groups D and G were orally challenged with approximately 2×109 CFU of wild-type SE, ST, and SG, respectively. Serum IgG titers and CD3+CD4+ T-cells, and CD3+CD8+ T-cells levels of groups B to D significantly higher than those of group A. In addition, all animals in groups A to C, E and F showed no clinical symptoms and survived after the virulent challenges, whereas one chicken in group D died and all chickens in group G died following the challenge. The protection against wild-type SE and ST in liver, spleen, cecum, and cloaca of groups B and C chickens was significant effective as compared with those in groups E and F. These indicate that the trivalent inactivated vaccine can be an effective tool for prevention of Salmonella infections by inducing robustly protective immune responses and cellular immune response in chickens.

Keywords: Salmonellosis, Zoonosis, Foultry, Fowl typhoid, Trivalent vaccine

서 론

살모넬라 식중독 감염의 가장 흔한 매개체로는 가금류와 계란으로 알려져 있으며, 살모넬라균에 감염된 닭의 난소 및 난관에서 난각이 형성되기 이전에 살모넬라균이 계란 내부에 오염되거나 산란 과정에서 난각에 오염될 수도 있다(Yang 등, 2010). 국내 식중독 발생 양상은 5년간(2017∼2021년) 평균 259회 발생하였으며, 평균 환자 수는 5,276명으로 매년 꾸준히 보고되고 있다. 이중 식중독 발생 환자수는 살모넬라 식중독이 가장 많은 것으로 나타나고 있으며 더욱이 집단 발생되는 식중독에서 살모넬라균으로 인한 경우가 높은 비율을 차지하고 있음이 보고되고 있다(Ministry of Food and Drug Safety, 2022; Jang 등, 2023).

국내에서 유행하는 살모넬라 혈청형은 Salmonella (S.) Enteritidis가 49%로 가장 높은 빈도로 보고되고 있으며, S. Typhimurium과 S. Typhi가 각각 15.8%와 7.9%를 차지하고 있다. 더욱이 S. Enteritidis와 S. Typhimurium이 차지하는 식중독 발생 비율은 64.8%에 달하는 것으로 보고되었다(Kim 등, 2006). S. Enteritidis 혈청형은 아시아에서 38%의 빈도로 분리 보고되고 있으며, 전 세계적으로도 가장 빈도가 높은 혈청형으로 알려져 있다(Galanis 등, 2006). S. Typhimurium은 1997년 이후 S. Enteritidis 다음으로 가장 높은 비율로 검출되는 혈청형으로 알려져 있으며, 세계적으로도 높은 빈도로 분리 보고되고 있어 그 중요도가 높아지고 있다(Kim 등, 2004; Helms 등, 2005).

Salmonella Gallinarum의 경우 가금티푸스의 원인균으로 산란계에서 심한 설사와 폐사가 특징이며 높은 폐사율을 보이는 세균성 전염병으로 한국에서는 1992년 처음 발병이 보고된 이후 전국으로 발생하고 있는바, 이는 가금티푸스에 취약한 갈색란을 생산하는 품종이 국내에서 주로 사육되고 있기 때문으로 보고되고 있다(Woo와 kim, 1998).

국내에서 가금티푸스 예방을 위해 SG9R과 같은 약독화 생균 백신이 사용되고 있는데 생균 백신은 장기간 방어 효과를 나타내고, 국소면역 및 세포 매개성 면역반응을 유도할 수 있다는 점에서 우수하다는 평가를 받고 있다(Lillehoj 등, 2000; Won 등, 2016). 하지만 살모넬라 약독화 생균 백신의 안전성 문제가 지속적으로 제기되고 있다. 그 이유로는 불완전한 백신주가 접종된 숙주에서 증식하는 과정에서 약독화된 병원성 유전자가 복귀되어 병원성을 회복할 가능성 때문이다(Barbezange 등, 2000). 반면 살모넬라 불활화 백신의 경우 살모넬라에 감염된 닭의 분변을 통한 균 배출이 감소됨과 더불어 계란 내 오염을 감소시키는 것으로 보고되었다(Gast 등, 1993; Jawale 등, 2014; Jawale과 Lee, 2016). 또한 불활화 백신은 높은 안전성을 가지고 있으며, 다른 살모넬라 혈청형과 혼합하여 다가백신으로 사용할 수 있는 응용성을 가지고 있다는 점에서 개발 및 상용화되어 판매되고 있다(Clifton-Hadley 등, 2002). 그렇지만 불활화 사균체 백신의 경우 백신을 접종한 대상 동물체 내의 면역반응에 의해 쉽게 제거될 수 있어 항원 발현이 제한적이라는 단점으로 인해 면역보강제(adjuvant)를 필요로 하며(Desin 등, 2013), 주로 체액성 면역을 유도하고 세포 매개성 면역반응 유도 능력은 약독화 생균 백신에 비해 현저히 떨어지는 단점을 지니고 있어 세포 매개성 면역 반응 유도가 반드시 필요한 세포 내 기생 세균 예방에 있어서는 예방 효과에 한계가 있다(Desin 등, 2013).

최근 불활화 사균체 백신임에도 신개념 사균체 백신인 고스트 백신은 세포 내 기생세균 예방에 필수적인 세포 매개성 면역반응을 유도하여 실험동물에서 살모넬라 감염을 효과적으로 예방하였다는 연구 결과 보고가 있으며, 살모넬라 사균체에 오일보조제(oil-adjuvant)를 혼합한 불활화 백신을 접종한 산란계에서 내부장기 내 살모넬라 분리율의 감소, 분변 내 살모넬라 배출 빈도 및 균량의 감소 등이 연구되었고(Gast 등, 1992; Barbezange 등, 2000, Jawale 등, 2014), 모계에서 생성된 면역 항체는 계란을 통해 병아리로 이행되어 부화 후 일정 기간 동안 살모넬라 야외 감염에 대한 방어력을 제공하는 것으로 보고되었다(Nicholas 등, 1991; Mailson 등, 2022).

따라서 본 연구에서는 국내에서 유행하고 있는 S. Enteritidis와 최근 그 중요성이 증가하고 있는 S. Typhimurium 및 닭의 폐사를 유발하는 가금 티푸스 원인균인 S. Gallinarum을 Chlorhexidine digluconate solution으로 불활화를 유도하여 3가 살모넬라 불활화 백신을 제조하여 산란계에서 체액성 및 세포 매개성 면역반응 유도 여부와 예방 효과를 평가하였다.

재료 및 방법

실험에 사용된 균주, 배양조건 및 프라이머

불활화 백신 제작 및 공격 접종 균주 그리고 백신 접종 후 항체역가를 측정하기 위한 ELISA coating을 위한 Outer membrane proteins (OMPs) 추출을 위한 균주는 국내 갈색 산란계에서 분리한 S. Enteritidis의 야생형 독성 분리주인 HJL345, S. Typhimurium의 야생형 독성 분리주인 HJL812, S. Gallinarum의 야생형 독성 분리주인 HJL465를 사용하였다(Table 1). 각 균주는 Luria-Bertani Broth (LB; Becton Dickinson, Sparks, MD, USA) 및 Brilliant green agar (BGA; BD Difco, USA)에 접종되어 37℃에서 배양되었다. 공격 접종 후 부검 시 비장과 간 등으로부터 분리된 균주의 혈청형을 확인하기 위해 사용된 Salmonella 특이 프라이머 및 S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 확인을 위한 특이 프라이머 염기서열은 아래 Table 2에 서술하였다.

Table 1 . Bacterial strains used for this study.

StrainDescriptionSource of reference
S. EnteritidisHJL345Isolates from Korean chicken in 2009Lab stock
S. TyphimuriumHJL812Isolates from Korean chicken in 2019Lab stock
S. GallinarumHJL465Isolates from Korean chicken in 2016Lab stock


Table 2 . Primer sequences and sizes of PCR-amplified targets.

PrimerSequence (5’-3’)Amplification targetAmplification length (bp)Reference
OMPCFATC GCT GAC TTA TGC AAT CGSalmonella genus204Alvarez et al. (2004)
OMPCRCGG GTT GCG TTA TAG GTC TG
ENTFTGT GTT TTA TCT GAT GCA AGA GGSalmonella Enteritidis304Alvarez et al. (2004)
ENTRTGA ACT ACG TTC GTT CTT CTG G
TYPHFTTG TTC ACT TTT TAC CCC TGA ASalmonella Typhimurium401Alvarez et al. (2004)
TYPHRCCC TGA CAG CCG TTA GAT ATT
SG-LGAT CTG CTG CCA GCT CAASalmonella Gallinarum252Kang et al. (2011)
SG-RGCG CCC TTT TCA AAA CAT A
SGP-LCGG TGT ACT GCC CGC TAT172
SGP-RCTG GGC ATT GAC GCA AA


실험 동물

살모넬라에 음성인 농장의 갈색 산란계 초생추 70수를 구입하여 실험에 사용하였다. 연구용 병아리는 실험에 사용된 백신 외에 어떠한 백신도 접종하지 않았으며, 시판 상업용 사료와 음료를 자유롭게 섭취할 수 있는 환경에서 사육되었다. 본 실험에서 보고된 동물실험은 Korean Council on Animal Care의 인가를 받은 전북대학교 동물윤리 위원회의 승인(JBNU2022-066)을 받아 진행하였다.

3가 살모넬라 불활화 백신 제조

3가 살모넬라 불활화 백신의 제작을 위해 Moon 등(2020)의 방법을 약간 변형하여 HJL345 (S. Enteritidis), HJL812 (S. Typhimurium), HJL465 (S. Gallinarum)를 Chlorhexidine digluconate solution (CHX; Merck KGaA, Darmstadt, Germany)으로 불활화를 유도하여 3가 살모넬라 불활화 백신을 제조하였다. 즉, 완전 불활화가 확인된 침전물을 ISA78 adjuvant (Seppic, Seoul, South Korea)와 3:7 비율로 혼합하여, 불활화 전 생균수 기준으로 S. Enteritidis 3×108+S. Typhimurium 1×108+S. Gallinarum 3×108의 균수로 총 7×108 cells/0.5 mL 농도로 혼합된 3가 살모넬라 불활화 백신으로 제조하여 4℃에 보관하며 실험에 사용하였다.

백신 접종 및 가검물 채취

사육된 갈색 산란계가 5주령이 되었을 때 무작위로 선별하여 7그룹(각 그룹 당 10수)으로 나누어 새로운 환경에 적응하도록 일주일간의 안정화 기간을 거친 후 6주령이 되었을 때 음성대조군 그룹 A는 아무 것도 접종하지 않았으며, 백신군인 B, C, D 그룹의 모든 닭은 살모넬라 3가 불활화 백신을 0.5 mL씩 6주령에 1차, 9주령에 2차로 근육 접종하였고, 각 균주별 양성대조군인 E, F, G 그룹의 경우 같은 시기에 각각 멸균 Phosphate-buffered saline (PBS) 0.5 mL씩 접종하였다(Table 3).

Table 3 . Animal experimental group design for trivalent vaccine experiment.

GroupnTypes of vaccinesChallenge strain
ANegative control10--
BVaccination10Trivalent vaccineS. Enteritidis
CVaccination10Trivalent vaccineS. Typhimurium
DVaccination10Trivalent vaccineS. Gallinarum
ESE positive cont.10PBSS. Enteritidis
FST positive cont.10PBSS. Typhimurium
GSG positive cont.10PBSS. Gallinarum
Total70


혈청은 0 weeks post prime immunization (1차 접종 전, 0 WPPI), 3 WPPI (2차 접종 전), 6 WPPI (공격접종 전)에 각각 채혈하여 준비하였다. 즉, 채취한 혈액은 3,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 혈청을 분리하였고, 분리된 혈청은 −20℃에 보관하여 실험에 사용하였다.

안전성 확인을 위한 체중 측정 및 상태 관찰

실험에 사용한 백신의 안전성을 평가하기 위하여 백신군과 대조군 모두 백신 접종 전, 1차 접종 3주 후, 2차 접종 3주 후에 닭 체중 측정 개체관리기(GI-1000, G-Tech International, Uijeongbu, Korea)를 사용하여 모든 개체의 체중을 측정하였고, 모든 개체는 하루에 두 번씩 발열, 설사, 식욕부진, 운동성 저하 및 폐사 여부를 확인하였다.

면역반응 평가를 위한 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

3가 살모넬라 불활화 백신 접종 후 S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum에 대한 혈청 immunoglobulinG (IgG) 항체 역가는 각 균주의 OMPs를 추출하여, 간접 효소면역 흡착 측정법(Indirect Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 각 S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum의 OMPs를 멸균 PBS로 0.2 µL/mL이 되도록 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 1%의 Skim milk (Becton Dickinson, Sparks, MD, USA)로 30분간 실온에서 blocking 한 후 WPPI 0, 3, 6에 분리한 혈청을 1:200으로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. Horseradish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-chicken IgG (Bethyl Lab Inc., Montgomery, TX, USA)로 1시간 반응시킨 후 o-phenylendiamine dihydrochloride substrate (Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA)으로 15분간 발색시킨 다음 stop solution (Sulfuric Acid, DUKSAN, Seoul, South Korea)으로 발색을 정지시켜 ELISA 분광도기계(Multiskan Go, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)에서 492 nm 파장으로 optical density (OD) 값을 측정하였다.

세포 매개성 면역반응 측정

세포 매개성 면역 반응 유도 여부를 확인하기 위해 Senevirathne 등(2021)의 방법을 약간 변형하여 Flow Cytometry Analysis에 의해 CD3+CD4+, CD3+CD8+ T-cells이 측정되었다. 즉, 살모넬라 불활화 3가 백신 접종 후 닭의 말초 혈액 내 CD3+CD4+, CD3+CD8+ T-cells 수치를 측정하기 위해 2차 백신 접종 후 2주째에 대조군인 A그룹에서 10수, 백신군인 B, C, D 그룹에서 무작위로 10수를 선별하여 채혈하였다. 1×106/well이 되도록 희석된 말초혈액 내 림프구는 각 300 ng/mL의 S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum OMPs으로 42℃, 5% CO2 조건에서 12시간 각각 재 자극 되었다. 재 자극된 세포는 anti-chicken CD3 Monoclonal Antibody (APC), anti-chicken CD4 Monoclonal Antibody (FITC), anti-chicken CD8 alpha Monoclonal Antibody (PE); (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 4℃에서 30분 동안 형광 염색한 후 BD Accuri™ C6 Plus Flow Cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T-cells 세포군의 분화 정도를 측정하였다. CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T-cells 세포군의 분화 정도는 FlowJo™ Software (BD Difco, USA)를 이용하여 분석되었다.

공격접종 및 생존률과 각 조직에서의 공격접종 균주 분리

국내 갈색 산란계에서 분리한 HJL345, HJL812, HJL465를 LB Broth 10 mL에 각각 접종하여 37℃ 배양기에서 16시간 배양하였다. 배양액을 신선한 LB Broth에서 재접종하여 OD600의 값이 0.6이 될 때까지 배양하였다. 배양액을 4,000 rpm으로 50분간 원심분리하여 상층액을 버리고 침전물을 PBS로 2회 세척하였다. 침전물을 10% sucrose (JUNSEI, Chuno-ku, Tokyo, Japan) 함유 PBS로 각 1×1010 CFU/mL이 되도록 재부유하여, 그룹 B, E의 닭 1수 당 S. Enteritidis를 200 µL씩, 그룹 C, F의 닭 1수 당 S. Typhimurium을 200 µL씩, 그룹 D, G의 닭 1수 당 S. Gallinarum를 200 µL씩 각각 경구접종하였다. 공격접종 후 14일 동안 하루에 두 번씩 설사, 식욕부진, 운동성 저하 및 폐사 여부를 관찰하고, 14일째 모든 생존개체를 희생시켜 간, 비장, 맹장, 총배설강 등으로부터 가검물을 채취하여 Nandre 등(2011)이 기술한 방법에 따라 각 살모넬라 균주를 분리하였으며, 분리된 균주는 Table 2에 기술된 특이 살모넬라 혈청형별 감별 프라이머를 사용하여 공격접종 균주 여부를 확인하였다.

통계분석

모든 실험 결과는 5.02 GraphPad software (San Diego, CA, USA)을 이용하여 Tukey’s multiple comparison test에 기반한 one-way analysis of variance (ANOVA)에 의해 평균 비교되었다. P의 값이 0.05 이하일 때 통계학적으로 유의성이 있다고 평가되었으며, 모든 결과는 평균±표준편차(mean±SD)로 표시되었다.

결 과

백신접종 후 안전성

1차 접종 후 3주 동안 체중 변화는 Fig. 1에서 보는 바와 같았다. 즉, 대조군은 1차 접종 후 3주 동안 평균 293.5±47.2 g 증가하였으며, 백신 접종군인 B∼D 산란계는 각각 243.5±40.7 g, 264.5±77.0 g, 245.0±101.8 g씩 증가하였다. 그리고 2차 접종 후 3주 동안 대조군이 304.5±118.5 g 증가하는 동안 백신 접종군인 B∼D 산란계는 각각 258.0±39.9 g, 236.5±94.0 g, 253.0±146.1 g씩 증가하였다. 하지만 PBS 접종 군인 E∼G 산란계는 대조군과 별반 차이가 없었다. 백신 접종군인 B∼D 및 PBS 접종군인 E∼G의 산란계 모두 1차 백신 접종 후 3주간 및 2차 백신 접종 후 3주간 발열, 설사, 식욕부진, 운동성 저하 및 폐사가 관찰되지 않았다.

Figure 1. Body weight gain post prime and boost immunization with the trivalent Salmonella inactivated vaccine or sterile PBS in chicken. Group A hens were non-immunized; groups B∼D hens were immunized with 7×108 cells/0.5 mL (S. Enteritidis 3×108+S. Typhimurium 1×108+S. Gallinarum 3×108) of the trivalent Salmonella inactivated vaccine, respectively; and groups E∼G hens were immunized with sterile PBS, respectively. Data shown are the means for all hens in each group, and error bars show the standard deviations (SD).

항체 역가

백신 접종 전, 백신 1차 접종 후, 2차 접종 후에 각각 정기적으로 채혈하여 각 살모넬라 OMPs를 이용한 ELISA로 혈청 IgG 항체 역가를 측정한 결과는 Fig. 2와 같았다. S. Enteritidis OMPs로 ELISA를 측정한 결과, 음성대조군인 A 그룹의 접종 전, 1차 접종 후, 2차 접종 후 항체 역가는 각 0.425±0.11, 0.509±0.18, 0.490±0.09로 측정되었고, 백신 접종군인 B∼D 그룹의 경우 접종 전은 각 0.491±0.11, 0.368±0.09, 0.480±0.10으로 음성대조군인 A 그룹과 비슷한 정도의 역가가 측정되었으나 1차 접종 후에는 1.227±0.07, 1.249±0.05, 1.269±0.11으로, 2차 접종 후에는 2.446±0.09, 2.450±0.11, 2.544±0.17로 점차 증가하였다. S. Typhimurium OMPs로 ELISA를 측정한 결과, 음성대조군인 A 그룹의 접종 전, 1차 접종 후, 2차 접종 후 항체역가는 각각 0.377±0.09, 0.462±0.16, 0.599±0.17인 반면 백신군인 B∼D 그룹에서 접종 전보다 1차 접종 후 각 1.634±0.12, 1.623±0.13, 1.654±0.15, 2차 접종 후 각 1.720±0.07, 1.709±0.07, 1.746±0.10으로 항체 역가가 상승하였다. 또한 S. Gallinarum OMPs로 ELISA를 측정한 결과, 음성대조군인 A그룹의 접종 전, 1차 접종 후, 2차 접종 후 항체 역가는 각각 0.514۪.15, 0.477۪.08, 0.576۪.27이었으며, 백신접종군인 B∼D 그룹에서 항체 역가는 1차 접종 후 1.668۪.18, 1.662۪.17, 1.671۪.12으로, 2차 접종 후 2.098۪.05, 2.063۪.08, 2.072۪.09으로 증가하였다. PBS 접종군인 E∼G 그룹은 S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum의 OMPs에 대해 접종 전, 1차 접종 후, 2차 접종 후 음성대조군과 비슷한 항체역가 관찰되었다.

Figure 2. Serum IgG titers against Salmonella Enteritidis OMPs (A), S. Typhimurium OMPs (B), and S. Gallinarum OMPs (C), respectively, in hens intramuscularly immunized with the trivalent Salmonella inactivated vaccine or sterile PBS. Group A hens were non-immunized; groups B∼D hens were immunized with 7×108 cells/0.5 mL (S. Enteritidis 3×108+S. Typhimurium 1×108+S. Gallinarum 3×108) of the trivalent Salmonella inactivated vaccine, respectively; and groups E∼G hens were immunized with sterile PBS, respectively. Data shown are the means for all hens in each group, and error bars show the standard deviations (SD). Asterisks indicate a significant difference between the values of the groups immunized with the vaccine candidate (*P<0.05) and those of the control group.

CD3+CD4+ T-cells, CD3+CD8+ T-cells

음성대조군인 A그룹과 백신 접종 그룹인 B∼D 그룹의 혈액에서 분리된 림프구를 각 S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum OMPs로 재 자극하고 CD3+CD4+ T-cells, CD3+CD8+ T-cells의 수치를 측정한 결과, 대조군에서의 CD3+CD4+ T-cells 백분율이 각각 16.28%±1.78, 17.22%±1.32, 18.4%±0.68인 반면, 백신 접종군에서의 CD3+CD4+ T-cells 백분율은 22.02%±2.01, 26.16%±1.3, 25.42±13.79로 측정되었다. 각 살모넬라 OMPs로 자극된 CD3+CD8+ T-cells 백분율은 음성대조군의 경우에는 각각 7.8%±1.45, 7.02%±1.03, 8.67%±0.77인 반면, 백신 접종군에서의 CD3+CD8+ T-cells 백분율은 11.24%±1.06, 9.86%±1.11, 12.56%±0.53로 측정되었다(Fig. 3).

Figure 3. T-cell immune responses. T-cell responses were evaluated by flow cytometry analysis of CD3+CD4+ and CD3+CD8+ cell populations using PBMC collected two weeks post the boost immunization. Cells were stimulated with S. Enteritidis (SE) OMPs, S. Typhimurium (ST) OMPs, and S. Gallinarum (SG) OMPs, respectively. (A) CD3+CD4+ T-lymphocytes population in immunized and nonimmunized chickens. (B) CD3+CD8+ Tlymphocytes population in immunized and non-immunized chickens. Values are shown as mean±standard deviation of 10 chickens per group.

공격접종 후 생존율 및 부검 결과

2차 백신 접종 후 3주째에 음성대조군인 A 그룹을 제외한 모든 그룹에 병원성 살모넬라 균주를 각 200 mL씩 경구접종 하였다. 즉, B, E 그룹에 S. Enteritidis, C, F 그룹에 S. Typhimurium, D, G 그룹에 S. Gallinarum을 마리 당 최종 공격접종 농도가 각 2×109 CFU/0.2 mL이 되게 하였고, 이후 14일간 폐사율을 확인하였다. 그 결과 Fig. 4에서 보는 바와 같이 음성대조군인 A 그룹 및 B, D, E, F 그룹은 10마리 중 10마리 모두 생존하였고, 백신 접종 후 S. Gallinarum을 공격접종한 D 그룹의 경우 공격접종 12일 차에 1수 폐사하여 부검일인 14일차까지 9수 모두 생존하였다. 하지만 S. Gallinarum을 공격접종 한 G 그룹의 경우 공격접종 9일차에 1마리, 10일차에 1마리, 11일차에 1마리, 12일차에 2마리, 13일차에 2마리, 14일차에 3마리가 각각 폐사하여 10마리 모두 폐사하였다(Fig. 4).

Figure 4. Survival rates after challenge with wild-type virulent S. Enteritidis, S. Typhimurium, or S. Gallinarum in all chickens of group B∼G at 6 WPPI. Group A hens were non-immunized; groups B∼D hens were immunized with 7×108 cells/0.5 mL (S. Enteritidis 3×108+S. Typhimurium 1×108+S. Gallinarum 3×108) of the trivalent Salmonella inactivated vaccine, respectively; and groups E∼G hens were immunized with sterile PBS, respectively. All hens in groups B and E, C and F, and D and G were challenged with S. Enteritidis, S. Typhimurium, and S. Gallinarum, respectively.

균분리 결과

부검 후 균분리 결과 음성대조군인 A 그룹에서는 직접도말 했을 때와 증균배양 했을 때 모두 균분리를 시도한 모든 조직에서 S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum이 검출되지 않았다. S. Enteritidis를 접종한 그룹인 B, E 그룹의 비장, 맹장, 총배설강에서 S. Enteritidis가 분리되었으나 직접도말 했을 때와 증균배양 했을 때 모두 백신접종군인 B 그룹은 PBS 접종군인 E 그룹에 비해 적은 개체에서 S. Enteritidis가 분리되었고, 두 경우 모두 간에서는 분리되지 않았다. S. Typhimurium을 공격접종한 그룹인 C와 F 그룹의 각 조직에서도 S. Typhimurium이 검출되었으나 백신 접종군인 C 그룹에서의 검출 두수가 PBS 접종군인 F그룹에 비해 더 적은 개체에서 균이 분리되었다. S. Gallinarum을 공격접종한 PBS 접종군인 G 그룹에서 모든 개체가 폐사하여 균분리가 시도되지 못했고, 백신 접종 그룹인 D 그룹에서는 1마리가 폐사하여 총 9수를 부검하여 균분리를 진행한 결과 간, 비장, 맹장, 총배설강에서 S. Gallinarum이 각각 분리되었다(Table 4).

Table 4 . Recovery of challenge strain from internal organs of the survived chickens.

Group/OrgansChallenge strainn**Direct culture (%)Enrichment culture (%)
LiverSpleenCecumCloacaLiverSpleenCecumCloaca
A-*1000000000
BS. Enteritidis1005 (50)1 (10)2 (20)050 (50)2 (20)2 (20)
CS. Typhimurium1003 (30)2 (20)0040 (4)30 (3)3 (30)
DS. Gallinarum95 (55.6)5 (55.6)2 (22.2)1 (11.1)6 (66.7)5 (55.6)3 (33.3)1 (11.1)
ES. Enteritidis1009 (90)6 (60)4 (40)010 (100)8 (80)8 (80)
FS. Typhimurium101 (10)4 (40)6 (60)7 (70)3 (30)8 (80)7 (70)8 (80)
GS. Gallinarum0--------

All chickens in groups B and E, C and F, and D and G were orally challenged with 2×109 CFU/0.2 mL of S. Enteritidis, S. Typhimurium, and S. Gallinarum, respectively, at 6 WPPI. All the chickens were euthanized at 14 days after-challenge. Statistical analysis carried out with Mann–Whitney U test. Group A hens were non-immunized; groups B∼D hens were immunized with 7×108 cells/0.5 mL (S. Enteritidis 3×108+S. Typhimurium 1×108+S. Gallinarum 3×108) of the trivalent Salmonella inactivated vaccine, respectively; and groups E∼G hens were immunized with sterile PBS, respectively..

*Non-challenged..

**This represents the number of chickens that survived to 14 days after challenge and were necropsied..


고 찰

닭에서 살모넬라균 배출 감소는 계란과 계육에서 살모넬라균 오염을 감소시킬 뿐만 아니라, 이는 살모넬라로 인한 사람 식중독 발생의 감소로 이어질 수 있다(Garmory 등, 2002). 따라서 닭에서 살모넬라 예방을 하기 위해 약독화 생균 백신과 불활화 사균백신이 상용화되어 사용되고 있지만, 일반적으로 살모넬라균은 세포 내 기생세균으로 세포성 면역 반응을 유도할 수 있는 약독화 생균백신이 불활화 백신에 비해 방어 효과가 더 우수하다고 알려져 있다(Desin 등, 2013). 그러나 약독화 생균백신의 안전성에 대한 문제가 주기적으로 제기되고 있어(Kang 등, 2009), 약독화 생균백신을 대체할 불활화 백신에 대한 요구가 증가하고 있는 추세이다. 불활화 백신에 의해 생성되는 항체는 주로 IgG이며, 주로 체액성 면역을 유도한다(Muotiala 등 1989; Gast 등, 1993). 최근 신개념 불활화 사균체가 마우스 및 가금에서 세포성 면역 반응을 유도하여 살모넬라를 효과적으로 예방하였다는 연구 결과 보고(Won 등, 2018; Moon 등, 2020; Senevirathne 등, 2021; Senevirathne 등, 2022)를 접할 수 있었다. 더욱이 불활화 백신은 여러 살모넬라 혈청형을 혼합하여 동시에 여러 혈청형을 동시에 예방할 수 있는 다가백신으로 사용할 수 있는 장점을 가지고 있다(Clifton-Hadley 등, 2002).

이에 본 연구에서 Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 함유 3가 불활화 사균체 백신으로서의 가능성을 평가하기 위해, Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 불활화 사균체를 오일보조제와 혼합하여 갈색 산란계를 대상으로 근육 접종하여 면역반응 유도 및 방어효과를 평가하였다. 우선 살모넬라 3가 불활화 사균체 혼합백신을 근육 접종한 후 발열, 설사, 식욕부진, 운동성 저하 및 체중 감소와 폐사 등과 같은 임상 증상을 관찰한 결과, 백신 접종된 산란계에서 통계학적으로 유의미한 체중 저하가 관찰되지 않았고, 다른 임상 증상 또한 관찰되지 않아 살모넬라 3가 불활화 백신의 안전성이 확인되었다. 이 결과는 Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 3가 백신이 산란계에서 근육으로 접종하는 백신 후보물질로서 안전하게 사용할 수 있음을 보여주는 결과였다.

혈액 내 높은 수준의 체액성 면역반응 유도는 감염된 동물이 세포 내 기생세균의 전신 감염을 방어하는데 매우 중요하다(Mastroeni 등, 2001; Alvarez 등, 2004; Kim 등, 2019; Moon 등, 2020). 이들 혈액 IgG 항체는 옵소닌 작용을 통해 감염된 동물에서 식세포의 작용을 극대화함으로써 혈액으로부터 병원성 세균을 제거하는데 있어 중요한 역할을 수행한다(Mittrücker 등, 2000; Mastroeni 등, 2001; Kim 등, 2019). 따라서 본 연구에서 살모넬라 불활화 3가 백신을 갈색 산란계에 근육접종한 후 채취한 혈청에서 각 S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum의 OMPs에 대한 특이 혈청 IgG 항체 역가를 측정하였다. 그 결과 각 S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum의 OMPs에 대한 항체 역가는 백신 접종 후 대조군 그룹 A는 접종 전과 비슷한데 반해, 그룹 B∼D의 항체 역가는 3WPPI 째에 점차적으로 증가되기 시작하여 6WPPI에는 대조군 그룹 A에 비해 모두 유의성 있는 항체 역가 증가가 관찰되었다(P<0.05). 하지만 PBS를 접종한 그룹 E∼G의 항체역가는 대조군과 별반 차이가 없었다. 이상의 결과는 Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 3가 백신을 갈색 산란계에 근육 접종하였을 경우 각 항원의 간섭작용 없이 각 항원별로 면역 항체를 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.

세포 내 기생세균인 살모넬라의 완벽한 제거를 위해서는 높은 체액성 면역반응 유도뿐 아니라 세포 매개 면역반응 유도는 반드시 필요하다(Norimatsu 등, 2004; Feng 등, 2005; Roesler 등, 2006; Brumme 등, 2007; Pascual 등, 2002; Hur 등, 2011; Moon 등, 2020). CD4+ 및 CD8+ T-cells는 살모넬라 제거를 위한 획득면역 형성에 특히 중요한 것으로 보고되고 있다(Nauciel 등, 1990; Mittrucker 등, 2000). CD4+ T-cells은 IFN-γ와 TNF-α와 같은 대식세포 활성화 사이토카인 생산 또는 유도를 통해 살모넬라 감염을 제어하는 것으로 알려져 있다(McSorley 등, 2000). 또한 CD4+ T-cells은 항체를 생산하는 B-cell을 지원하고 살모넬라 특이 CD8+ T-cells의 생성에 도움을 주는 것으로 알려져 있다(Mittrucker 등, 2000). CD8+ T-cells은 감염된 세포의 용해를 유도함으로써 살모넬라가 식세포나 다른 자연살해세포 등에 노출될 수 있도록 하고, 식세포를 불러 모으고 활성화에 필요한 사이토카인을 생성한다(Stenger 등, 1998; Mittrücker 등, 2002). Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 3가 백신을 근육 접종한 후 측정한 말초혈액 내 CD3+CD4+ T-cells과 CD3+CD8+ T-cells은 대조군에 비해 유의성 있는 유도가 확인되었다. 이상의 결과로 Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 백신을 근육 접종 할 경우 불활화 사균체 백신임에도 불구하고 체액성 면역 반응뿐만 아니라 세포 매개 면역 반응을 유도할 수 있음이 확인되었다.

Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 3가 백신을 접종한 그룹에서는 병원성 S. Enteritidis를 공격접종 했을 때 증균 배양을 통한 균 분리 시 맹장과 총배설강에서 각 20%, 비장에서 50%의 비율로 공격접종 균주인 S. Enteritidis가 각각 분리된 반면, PBS를 접종하고 병원성 S. Enteritidis로 공격접종 한 경우에는 최소 80%의 비율로 분리되었다. 더불어 병원성 S. Typhimurium을 경구로 공격접종 한 경우, 면역화된 그룹에서는 맹장과 총배설강에서 각 30%, 비장에서 40%의 비율로 공격접종 균주가 분리된 반면, PBS를 접종하고 공격접종 한 경우에는 최소 70%의 비율로 분리되었고, 더불어 백신 접종군에서는 분리되지 않았던 간에서도 30%의 개체에서 공격접종 균주가 분리되었다. 또한 병원성 S. Gallinarum을 경구로 공격접종 하였을 경우, 면역화된 그룹에서는 공격접종 후 12일째에 1수에서 폐사가 관찰되어 90%의 생존율이 관찰되었지만, PBS를 접종한 그룹에서는 공격접종 7일째부터 식욕 부진 및 운동 실조 등이 관찰되었고, 9일째부터 폐사가 시작되어 14일째 모두 폐사하여 폐사율이 100%로 관찰되었다. 이를 통해 Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 3가 백신이 각 병원성 살모넬라에 대해 높은 면역 반응을 유도를 통해 높은 방어 효과가 있음을 확인하였다. 하지만 보다 완벽한 방어를 위해서는 각 살모넬라 불활화 사균체의 혼합 비율 및 접종량 변경 그리고 기존 판매되고 있는 SG9R과 연계된 접종 프로그램 최적화 실험 등 추가 연구가 필요하다고 사료된다.

결 론

본 연구는 사람에게서 식중독을 일으키는 주요 원인균인 살모넬라를 예방하기 위해서 살모넬라 3가 불활화 백신을 제조하여 체액성 및 세포성 면역 반응 유도와 공격접종 균주에 대한 방어효과를 평가하였다. S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 혈청형을 Chlorhexidine을 이용하여 불활화 시키고 오일보조제와 혼합하여, Chlorhexidine-inactivated S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 3가 백신을 제작하여 산란계에 2회 근육으로 예방 백신을 접종 시킨 결과, 각 항원이 서로 간섭 작용을 하지 않고 체액성 및 세포성 면역반응을 효과적으로 유도함을 확인하였다. 더불어 살모넬라 3가 불활화 백신을 2회 접종 후 각 병원성 S. Enteritidis, S. Typhimurium 및 S. Gallinarum 균주로 공격접종 하여 각 균주에 대한 방어 여부를 확인해 본 결과, 각 병원성 균주를 효과적으로 방어하는 것이 확인되었다. 이상의 결과를 종합해 보면, 살모넬라 3가 불활화 백신을 근육접종을 통해 백신접종할 경우 갈색 산란계에서 살모넬라 감염을 효과적으로 방어할 수 있음이 확인되었다. 하지만 공격접종 후 보다 완벽한 예방 효과를 위해서는 각 살모넬라 불활화 사균체의 백신 제조 시 혼합 비율 및 접종량의 조절 그리고 약독화 생균 백신인 SG9R과 연계한 백신접종 프로그램 최적화 등 추가 연구가 필요하다고 생각된다.

감사의 글

이 논문은 정부의 재원으로 농림식품기술기획평가원(Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture and Forestry, IPET)의 지원을 받아 연구되었습니다(No. 122007-2).

CONFLICT OF INTEREST

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Fig 1.

Figure 1.Body weight gain post prime and boost immunization with the trivalent Salmonella inactivated vaccine or sterile PBS in chicken. Group A hens were non-immunized; groups B∼D hens were immunized with 7×108 cells/0.5 mL (S. Enteritidis 3×108+S. Typhimurium 1×108+S. Gallinarum 3×108) of the trivalent Salmonella inactivated vaccine, respectively; and groups E∼G hens were immunized with sterile PBS, respectively. Data shown are the means for all hens in each group, and error bars show the standard deviations (SD).
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Fig 2.

Figure 2.Serum IgG titers against Salmonella Enteritidis OMPs (A), S. Typhimurium OMPs (B), and S. Gallinarum OMPs (C), respectively, in hens intramuscularly immunized with the trivalent Salmonella inactivated vaccine or sterile PBS. Group A hens were non-immunized; groups B∼D hens were immunized with 7×108 cells/0.5 mL (S. Enteritidis 3×108+S. Typhimurium 1×108+S. Gallinarum 3×108) of the trivalent Salmonella inactivated vaccine, respectively; and groups E∼G hens were immunized with sterile PBS, respectively. Data shown are the means for all hens in each group, and error bars show the standard deviations (SD). Asterisks indicate a significant difference between the values of the groups immunized with the vaccine candidate (*P<0.05) and those of the control group.
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Fig 3.

Figure 3.T-cell immune responses. T-cell responses were evaluated by flow cytometry analysis of CD3+CD4+ and CD3+CD8+ cell populations using PBMC collected two weeks post the boost immunization. Cells were stimulated with S. Enteritidis (SE) OMPs, S. Typhimurium (ST) OMPs, and S. Gallinarum (SG) OMPs, respectively. (A) CD3+CD4+ T-lymphocytes population in immunized and nonimmunized chickens. (B) CD3+CD8+ Tlymphocytes population in immunized and non-immunized chickens. Values are shown as mean±standard deviation of 10 chickens per group.
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Fig 4.

Figure 4.Survival rates after challenge with wild-type virulent S. Enteritidis, S. Typhimurium, or S. Gallinarum in all chickens of group B∼G at 6 WPPI. Group A hens were non-immunized; groups B∼D hens were immunized with 7×108 cells/0.5 mL (S. Enteritidis 3×108+S. Typhimurium 1×108+S. Gallinarum 3×108) of the trivalent Salmonella inactivated vaccine, respectively; and groups E∼G hens were immunized with sterile PBS, respectively. All hens in groups B and E, C and F, and D and G were challenged with S. Enteritidis, S. Typhimurium, and S. Gallinarum, respectively.
Korean Journal of Veterinary Service 2023; 46: 303-314https://doi.org/10.7853/kjvs.2023.46.4.303

Table 1 . Bacterial strains used for this study.

StrainDescriptionSource of reference
S. EnteritidisHJL345Isolates from Korean chicken in 2009Lab stock
S. TyphimuriumHJL812Isolates from Korean chicken in 2019Lab stock
S. GallinarumHJL465Isolates from Korean chicken in 2016Lab stock

Table 2 . Primer sequences and sizes of PCR-amplified targets.

PrimerSequence (5’-3’)Amplification targetAmplification length (bp)Reference
OMPCFATC GCT GAC TTA TGC AAT CGSalmonella genus204Alvarez et al. (2004)
OMPCRCGG GTT GCG TTA TAG GTC TG
ENTFTGT GTT TTA TCT GAT GCA AGA GGSalmonella Enteritidis304Alvarez et al. (2004)
ENTRTGA ACT ACG TTC GTT CTT CTG G
TYPHFTTG TTC ACT TTT TAC CCC TGA ASalmonella Typhimurium401Alvarez et al. (2004)
TYPHRCCC TGA CAG CCG TTA GAT ATT
SG-LGAT CTG CTG CCA GCT CAASalmonella Gallinarum252Kang et al. (2011)
SG-RGCG CCC TTT TCA AAA CAT A
SGP-LCGG TGT ACT GCC CGC TAT172
SGP-RCTG GGC ATT GAC GCA AA

Table 3 . Animal experimental group design for trivalent vaccine experiment.

GroupnTypes of vaccinesChallenge strain
ANegative control10--
BVaccination10Trivalent vaccineS. Enteritidis
CVaccination10Trivalent vaccineS. Typhimurium
DVaccination10Trivalent vaccineS. Gallinarum
ESE positive cont.10PBSS. Enteritidis
FST positive cont.10PBSS. Typhimurium
GSG positive cont.10PBSS. Gallinarum
Total70

Table 4 . Recovery of challenge strain from internal organs of the survived chickens.

Group/OrgansChallenge strainn**Direct culture (%)Enrichment culture (%)
LiverSpleenCecumCloacaLiverSpleenCecumCloaca
A-*1000000000
BS. Enteritidis1005 (50)1 (10)2 (20)050 (50)2 (20)2 (20)
CS. Typhimurium1003 (30)2 (20)0040 (4)30 (3)3 (30)
DS. Gallinarum95 (55.6)5 (55.6)2 (22.2)1 (11.1)6 (66.7)5 (55.6)3 (33.3)1 (11.1)
ES. Enteritidis1009 (90)6 (60)4 (40)010 (100)8 (80)8 (80)
FS. Typhimurium101 (10)4 (40)6 (60)7 (70)3 (30)8 (80)7 (70)8 (80)
GS. Gallinarum0--------

All chickens in groups B and E, C and F, and D and G were orally challenged with 2×109 CFU/0.2 mL of S. Enteritidis, S. Typhimurium, and S. Gallinarum, respectively, at 6 WPPI. All the chickens were euthanized at 14 days after-challenge. Statistical analysis carried out with Mann–Whitney U test. Group A hens were non-immunized; groups B∼D hens were immunized with 7×108 cells/0.5 mL (S. Enteritidis 3×108+S. Typhimurium 1×108+S. Gallinarum 3×108) of the trivalent Salmonella inactivated vaccine, respectively; and groups E∼G hens were immunized with sterile PBS, respectively..

*Non-challenged..

**This represents the number of chickens that survived to 14 days after challenge and were necropsied..


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Dec 30, 2023 Vol.46 No.4, pp. 255~368

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Korean Journal of
Veterinary Service

eISSN 2287-7630
pISSN 1225-6552
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