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Korean J. Vet. Serv. 2022; 45(3): 191-199
Published online September 30, 2022
https://doi.org/10.7853/kjvs.2022.45.3.191
© The Korean Socitety of Veterinary Service
홍세림ㆍ강혜정ㆍ문진산ㆍ윤순식ㆍ김하영*
농림축산검역본부 세균질병과
Correspondence to : Ha-Young Kim
E-mail: kimhy@korea.kr
https://orcid.org/0000-0002-1332-3832
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0). which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
We investigated the virulence genes, O-serotypes, antimicrobial resistance of pathogenic E. coli isolated from carcasses (n=455) and environmental (n=372) samples of 11 cattle and 12 pig slaughterhouses from December 2020 to December 2021. E. coli were isolated from nine carcasses (2.0%), three slaughter facilities (1.4%), two utensils (2.7%) and three abattoir workers (3.5%) from four cattle and four pig slaughterhouses. Among all isolates, 13 STEC (76.5%) were identified, followed by four EPEC (23.5%). As a result of the antibiotic susceptibility test, all isolates were resistant to at least one antimicrobial, of which 70.6% isolates showed multidrug resistance patterns. The serotypes were diverse in pigs compared to cattle, with serotypes O18, O66, O109 in cattle and O9, O76, O85, O100, O153, and O159 in pigs. In a single cattle slaughterhouse, eight STEC O66 were isolated from various types of sample (4 slaughter animal surfaces, 3 gloves, and 1 knife) with two antimicrobial resistance patterns (CHL-FIS-STR and CHL-FIS). Those two types of strain were suspected crosscontamination from utensils to slaughter animal surfaces. These results showed that pathogenic E. coli were detected in carcasses and various environmental samples in cattle and pig slaughterhouses. Nationwide monitoring and hygiene management are required to prevent cross-contamination of STEC isolate slaughterhouses.
Keywords Cattle, Pig, Slaughterhouse, Pathogenic Escherichia coli
병원성 대장균은 독소생성과 부착인자의 생산 유무, 임상증상 등에 따라 장병원성 대장균(Enteropathogenic
식중독의 주요 원인체 중 하나인 병원성 대장균은 오염된 식품이나 물의 섭취, 동물, 환자와의 접촉에 의한 감염, 도축 중 잘못된 가공 방법에 의해 가축의 배설물이 식육에 오염되었을 경우에 식중독을 일으킨다. 미국 질병통제예방센터(CDC)에서는 매년 STEC O157이 약 96,000건, STEC non-O157이 약 169,000건의 질병을 유발하는 것으로 추정했다(CDC, 2018). 유럽 질병통제예방센터(ECDC)에 따르면 29개 국가에서 2015년에서 2019년까지 매년 약 6,100∼8,600건의 STEC 감염사례가 보고되었고(ECDC, 2021), 일본 국립감염병연구소(NIID)에서는 2019년과 2020년에 걸쳐 매년 약 3,000건의 EHEC 감염사례를 보고하였다(Hibiya 등, 2022). 국내 식품의약품안전처 자료에 따르면 최근 10년간 주요 세균성 식중독 원인균 중 1위는 병원성 대장균으로 2021년도에는 총 30건, 585명의 환자가 발생하였으며, 전체 세균성 식중독의 26%를 차지하였다(MFDS, 2022).
외국의 여러 연구에 따르면 도축장 등 생산단계 식육에서도 병원성 대장균이 검출되고 있으며(Shinagawa 등, 2000; Tutenel 등, 2003; Hu 등, 2021), 이 병원체를 효율적으로 제어하기 위해 도축과정 중 식중독균을 모니터링하는 것은 안전한 식품 생산에 있어서 매우 중요하게 여겨지고 있다(Santos 등, 2017; Santos 등, 2018). 국내에서는 일부 특정 지역을 대상으로 유통 중인 닭고기, 소고기, 돼지고기에서의 병원성 대장균에 대한 연구는 수행된 바 있다(Kim 등, 2009; Lee 등, 2009; Cho 등, 2017; Lee 등, 2021). 하지만 전국 단위의 도축장 도체 및 작업시설, 도구, 작업자 등 환경 유래 병원성 대장균 검출에 대한 연구가 거의 없는 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 국내 소와 돼지 도축장 내 도체 및 환경 시료를 대상으로 병원성 대장균의 분포를 조사하고 분리주의 특성을 분석하여 보고하고자 한다.
2020년 12월부터 2021년 12월까지 전국의 9개 시·도에 소재한 소 도축장 11개소에서 채취한 380건(예냉실 도체 110건, 도축과정의 도체 95건, 시설 101건, 도구 34건, 작업자 40건) 및 돼지 도축장 12개소에서 채취한 447건(예냉실 도체 120건, 도축과정의 도체 130건, 시설 112건, 도구 40건, 작업자 45건) 총 827건의 시료를 대상으로 대장균 분리를 수행하였다.
도축장 예냉실과 도축과정의 소와 돼지 도체 시료는 식품공전(MFDS, 2020)의 방법으로 10 mL buffered peptone water (BPW; Difco BD, Sparks, MD)가 함유된 멸균 스폰지(Nasco, Fort Atkinson, WI, USA)를 이용하여 채취하였다. 환경 시료 부위는 작업장 시설(계류장, 개수대, 장기적출대, 배수구, 벽, 바닥), 예냉실(벽, 바닥), 작업자(장갑, 장화), 도구(칼, 톱)가 포함되었으며, 각 구역 간 오염이 가장 심한 것으로 생각되는 부위를 10×10 cm씩 약 100 cm2의 면적을 동일한 스폰지로 3부분 문질러서 시료 채취하였다. 시료는 24시간 이내에 냉장 상태로 운반하여 실험하였다.
병원성 대장균 분리는 식품공전 및 식중독 원인조사 시험법(MFDS, 2019)에 수록된 식중독 스크리닝 검사법을 일부 변형하여 실험하였다. 시료 채취한 멸균 스펀지에 BPW 30 mL을 넣어 스토마커(Stomacher 80, Biomaster, Seward, UK)로 30초간 균질화시킨 후 1 mL을 증균배지인 modified EC broth with novobiocin (Merck, Berlin, Germany)에 접종하여 37℃에서 18∼24시간 동안 배양하였다. 배양액 1 mL을 13,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 버리고 원심침사에 멸균 증류수 100 µL로 현탁 후 boiling 방법으로 얻은 것을 template DNA로 사용하였다. 식품공전에 수록된 실시간유전자검사법(Real-Time PCR)은 STEC (
분리된 병원성 대장균을 대상으로 Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2020) 및 National Antimicrobial Resistance Monitoring System (NARMS, 2021)의 기준에 따라 16종 항생제(amoxicillin/clavulanic acid, ampicillin, cefepime, cefoxitin, ceftazidime, ceftiofur, chloramphenicol, ciprofloxacin, colistin, gentamicin, meropenem, nalidixic acid, streptomycin, sulfisoxazole, tetracycline, trimethoprim/sulphamethoxazole)가 코팅된 KRNV5F Sensititre Panel (Trek Diagnistic Systems, Cleveland, OH, USA)을 사용하여 액체배지희석법으로 최소억제농도(Minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하였다. 항생제 감수성검사의 quality control 균주로는
혈청형 검사는 O-genotyping PCR법과 O-serotyping으로 동시에 실시하였다. O-genotyping PCR은 이전 연구에 따라 병원성 대장균 항혈청 185종(O14와 O57을 제외한 O1-O187)에 대하여
소, 돼지 도축장의 도체, 시설, 도구, 작업자로부터 분리된 병원성 대장균의 분리 현황은 Table 1과 같으며, Genelix™ Real-Time PCR과 일반 PCR법 간의 검출률에 있어서 동일한 결과를 확인할 수 있었다. 소 도축장 11개소 중 4개소(C, E, I, K)에서 11주(2.9%)의 병원성 대장균이 분리되었으며, 이 중 도체 시료는 도축과정 도체 5건(5.3%)과 예냉실 도체 1건(0.9%)에서 각각 분리되었다. 환경 시료는 작업장 시설에서 0.5% (1/101), 도구에서 2.9% (1/34), 작업자에서 7.5% (3/40)로 조사되었으며, 그중에서도 작업자가 사용하는 장갑에서 가장 높게 분리되었다. 이외에 계류장과 칼에서도 각각 검출되었다. 돼지 도축장에서는 12개소 중 4개소(M, N, U, W)에서 6주(1.3%)의 병원성 대장균이 분리되었다. 이 중 도체 시료는 도축과정 도체 2건(1.5%)과 예냉실 도체 1건(0.8%)에서 각각 분리되었다. 환경 시료는 작업장 시설에서 1.8% (2/112), 도구에서 2.5% (1/40)로 소 도축장에 비해 상대적으로 낮은 검출률을 보였다. 이외에 개수대, 장기적출대, 칼에서도 각각 검출되었다. 이와 같이 소, 돼지 도축장의 다양한 시료에서 병원성 대장균이 검출되었다. 이러한 결과는 국내에서 Lee 등(2021)이 광주지역에서 유통·판매되는 소고기에서 24.4% (82/335), Choi 등(2010)이 소매시장 돼지고기에서 18.6% (175/943), Lee 등(2009)이 육류 가공시설 및 판매점 쇠고기에서 4.1% (31/750), 돼지고기에서 14.6% (201/1350)의 검출률보다는 비교적 낮은 분리율을 나타내었다. 이러한 결과는 시료 채취 장소, 조사, 시기, 환경 여건, 균분리 방법의 차이에 의한 것으로 생각된다(Hong 등, 2009).
Table 1 . Isolation of pathogenic
Sampling site | Isolation from 11 cattle slaughterhouses | Total (%) (n=380) | Isolation from 12 pig slaughterhouses | Total (%) (n=447) | |||||||||||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
A (n=21) | B (n=21) | C (n=21) | D (n=21) | E (n=50) | F (n=56) | G (n=53) | H (n=50) | I (n=47) | J (n=20) | K (n=50) | L (n=21) | M (n=21) | N (n=21) | O (n=21) | P (n=27) | Q (n=57) | R (n=21) | S (n=64) | T (n=57) | U (n=59) | V (n=21) | W (n=57) | |||
Carcasses (n=455) | 6 (2.9) | 3 (1.2) | |||||||||||||||||||||||
Slaughter animal surface (n=225) | NT* | NT | NT | NT | 4 | NT | 1 | NT | 5 (5.3) | NT | NT | NT | NT | NT | NT | 1 | NT | 1 | 2 (1.5) | ||||||
Chilling room carcass (n=230) | 1 | 1 (0.9) | 1 | 1 (0.8) | |||||||||||||||||||||
Facilities (n=213) | 1 (1.0) | 2 (1.8) | |||||||||||||||||||||||
Lairage (n=50) | NT | NT | NT | NT | NT | NT | 1 | 1 (4.0) | NT | NT | NT | NT | NT | NT | NT | 0 | |||||||||
Slaughter sites | |||||||||||||||||||||||||
Sink (n=23) | 0 | 1 | 1 (7.7) | ||||||||||||||||||||||
Evisceration table (n=23) | 0 | 1 | 1 (8.3) | ||||||||||||||||||||||
Drain (n=23) | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||
Wall and floor (n=48) | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||
Chilling room | |||||||||||||||||||||||||
Wall and floor (n=46) | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||
Utensils (n=74) | 1 (2.9) | 1 (2.5) | |||||||||||||||||||||||
Knives (n=51) | 1 | 1 (4.3) | 1 | 1 (3.6) | |||||||||||||||||||||
Saw (n=23) | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||
Abattoir workers (n=85) | 3 (7.5) | 0 | |||||||||||||||||||||||
Gloves (n=62) | 3 | 3 (10.0) | 0 | ||||||||||||||||||||||
Boots (n=23) | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||
Total (%) | 1 (4.8) | 8 (16.0) | 1 (2.1) | 1 (2.0) | 11 (2.9) | 2 (9.5) | 1 (4.8) | 2 (3.4) | 1 (1.8) | 6 (1.3) |
*NT, not tested.
분리된 17개의 병원성 대장균 중 STEC이 13주(76.5%),
Table 2 . Pathotypes of
Source | No. of samples | No. of isolates (%) | STEC (n=13) | EPEC (n=4) |
---|---|---|---|---|
Cattle | ||||
Carcasses | 205 | 6 (2.9) | 6 | 0 |
Environment | 175 | 5 (2.9) | 4 | 1 |
Pigs | ||||
Carcasses | 250 | 3 (1.2) | 1 | 2 |
Environment | 197 | 3 (1.5) | 2 | 1 |
STEC, Shiga toxin-producing
분리된 병원성 대장균에 대한 항생제 내성은 소 유래의 STEC은 CHL (100%), FIS (90.0%), STR (70.0%)에서만 내성을 보였고 EPEC은 CHL, FIS, STR, SXT에서 100% 내성을 보였다(Fig. 1). 돼지 유래의 STEC은 CHL (100%), FIS (66.7%), SXT (66.7%)에서 높은 내성을 보였고, EPEC은 CHL (100%), TET (100%), FIS (100%), STR (66.7%), AMP (66.7%)에서 높은 내성을 나타냈다. AmC, FOX, CAZ, XNL, CIP, GEN, NAL은 돼지 유래의 STEC에서만 33.3% 정도의 내성을 보였다. 이러한 결과는 국내에서 Kim 등(2013)이 서울지역에서 유통 중인 소고기와 돼지고기에서 조사된 결과와 유사한 것으로 나타났다. 국내산 축산물에서 대장균을 분리하여 항생제의 내성률을 조사한 결과, 소고기 유래 대장균은 모든 항생제에 대하여 30% 미만으로 낮게 나타났지만, 돼지고기 유래 대장균은 AMP, FIS, CHL, STR, TET은 60% 이상의 균주에서 내성률을 보이는 결과와 유사한 것으로 나타났다(APQA, 2020).
항생제 다제 내성 분포 양상을 조사한 결과, 모든 균주는 한 가지 이상의 항생제에 내성을 나타냈으며, 3종류 이상의 항생제에 내성을 가지는 다제 내성균은 분리주의 70.6%로 총 6가지 양상으로 확인되었다(Table 3). 병원형별 다제 내성률은 STEC의 경우 소에서 70.0% (7/10), 돼지에서 33.3% (1/3)인 반면, EPEC은 소와 돼지에서 분리된 4주 모두 다제 내성을 나타냈으며 유형도 모두 다르게 나타났다. 이러한 결과는 Kim 등(2014)이 학교급식에서 병원성 대장균의 다제 내성은 EPEC과 EAEC에만 있었고 EPEC에서 다제 내성의 유형이 다양하다고 보고한 결과와는 다른 양상을 보이는 것으로 나타났다.
Table 3 . Characterization of pathogenic
Animal | Slaughter-house name | Sampling sites | No. of isolates | Pathotype | Virulence factor | Serotype | Resistance pattern |
---|---|---|---|---|---|---|---|
Cattle (n=11) | C | Chilling room carcass | 1 | STEC | O66 | CHL-FIS-STR (MDR) | |
E | Slaughter animal surface | 3 | STEC | O66 | CHL-FIS-STR (MDR) | ||
E | Gloves | 2 | STEC | O66 | CHL-FIS-STR (MDR) | ||
E | Knife | 1 | STEC | O66 | CHL-FIS-STR (MDR) | ||
E | Slaughter animal surface | 1 | STEC | O66 | CHL-FIS | ||
E | Gloves | 1 | STEC | O66 | CHL-FIS | ||
I | Slaughter animal surface | 1 | STEC | O109 | CHL | ||
K | Lairage | 1 | EPEC | O18 | CHL-STR-FIS/SXT (MDR) | ||
Pigs (n=6) | M | Evisceration table | 1 | STEC | O9 | AmC-AMP-FOX-CAZ/XNL-CHL-CIP-NAL-FIS/SXT (MDR) | |
M | Sink | 1 | EPEC | O85 | CHL-FIS-STR-TET (MDR) | ||
N | Chilling room carcass | 1 | EPEC | O153 | AMP-CHL-STR-FIS/SXT-TET (MDR) | ||
U | Slaughter animal surface | 1 | STEC | O159 | CHL-GEN/STR | ||
U | Knife | 1 | STEC | O100 | CHL-FIS/SXT | ||
W | Slaughter animal surface | 1 | EPEC | O76 | AMP-CHL-FIS-TET (MDR) |
CHL, Chloramphenicol; FIS, Sulfisoxazole; STR, Streptomycin; SXT, Trimethoprim/Sulphamethoxazole; AMP, Ampicillin; TET, Tetracycline; AmC, Amoxicillin/Clavulanic Acid; FOX, Cefoxitin; CAZ, Ceftazidime; XNL, Ceftiofur; CIP, Ciprofloxacin; GEN, Gentamicin; NAL, Nalidixic Acid.
MDR, multidrug resistance (resistant to at least three antimicrobial subclasses).
분리된 병원성 대장균 17주에 대한 혈청형을 O-genotyping PCR법과 O-serotyping으로 확인했을 때 동일한 결과를 얻었으며, 돼지에서 분리 균주 수에 비해 다양한 혈청형이 확인되는 등 축종별로 차이가 있었다. 소에서는 O18 (1주, 9.1%), O66 (9주, 81.8%), O109 (1주, 9.1%) 총 3종이 확인되었고 돼지에서는 O9, O76, O85, O100, O153, O159가 각 1주씩 총 6종의 혈청형이 확인되었다(Table 3). 미국, 유럽, 일본 등에서 non-O157 STEC 감염의 약 70%는 O26, O45, O91, O103, O111, O113, O121, O128, O145 혈청형에 의해 발생된다고 보고된 바 있다(CDC, 2018; NIID, 2020; Panel 등, 2020). 하지만 본 연구에서는 이러한 혈청형이 확인되지 않았다. 국내 분리 식육 유래 병원성 대장균의 주요 혈청형은 Park 등(2015)이 도축장 및 소매시장 소고기에서 O55, O126, 돼지고기에서 O1, O27, O55, O86, O114, O168이었으며, Lee 등(2009)이 육류 가공시설 및 판매점 소고기에서 O8, O18, O86, O119, O136, 돼지고기에서 O128이 확인됨에 따라 국내 식육에서는 다양한 유형의 혈청형이 분포되고 있을 것으로 추정된다.
본 연구에서
위의 연구결과를 종합해 볼 때 국내 소, 돼지 도축장에서 병원성 대장균의 경우 STEC과 EPEC만 많이 검출되었고, 다양한 혈청형이 분리되었지만, 일부 도축장에서 동일한 유형의 병원형과 혈청형이 존재하여 교차오염 가능성이 제기되었다. 향후 좀 더 많은 도축장을 대상으로 PFGE (pulsed-field gel electrophoresis)나 sequence-based typing 기술을 이용하여 분자역학적 분석을 통한 병원성 대장균에 대한 오염경로 구명이 필요할 것으로 생각된다.
2020년 12월부터 2021년 12월까지 전국 9개 시·도에 소재하는 소 도축장 11개소, 돼지 도축장 12개소의 도체 455건 및 환경 시료 372건에서 병원성 대장균을 분리하고 특성을 조사하였다. 병원성 대장균은 소 도축장 4개소, 돼지 도축장 4개소에서 도체 시료 9건(2.0%), 작업장 시설 3건(1.4%), 도구 2건(2.7%), 작업자에서 3건(3.5%) 분리되었다. 17개 분리주의 병원형 분포는 STEC 76.5% (13/17) 및 EPEC 23.5% (4/17)로 확인되었으며, EHEC, ETEC, EAEC 및 EIEC는 검출되지 않았다. 항생제 감수성 검사 결과 모든 균주는 한 가지 이상의 항생제에 내성을 보였으며, 3종류 이상의 항생제에 내성을 가지는 다제 내성균은 분리주의 70.6%로 총 6가지 양상으로 확인되었다. 혈청형을 축종별로 분류한 결과, 소에서는 O18 1주, O66 9주, O109 1주 총 3종이 확인되었고, 돼지에서는 O9, O76, O85, O100, O153, O159가 각 1주씩 총 6종의 혈청형이 확인되었다. 소 도축장 E에서는 도축 중 도체 표면(4주), 장갑(3주), 칼(1주)에서 분리된 병원성 대장균은 모두 STEC O66으로 확인되었으며, 항생제 내성 패턴이 CHL-FIS-STR인 균주들은 장갑과 칼에서 도체 표면으로, CHL-FIS인 균주들은 장갑에서 도체 표면으로 교차오염이 의심되었다. 이 연구를 통하여 소 및 돼지 도축장의 도체와 다양한 환경에 대한 병원성 대장균의 오염이 확인된 바, 이와 같은 병원성 대장균의 효과적인 관리를 위해서 도축장 환경에서의 오염원 차단 및 교차오염이 발생하지 않도록 모니터링 및 위생관리가 더욱 강화되어야 할 것으로 생각된다.
본 연구는 농림축산검역본부의 농림축산검역검사기술개발사업(과제명: 도축장 내 클로스트리듐과 예르시니아균 오염실태 및 특성조사, B-1543081-2022-23-02)의 연구비 지원에 의해 수행되었다.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
Korean J. Vet. Serv. 2022; 45(3): 191-199
Published online September 30, 2022 https://doi.org/10.7853/kjvs.2022.45.3.191
Copyright © The Korean Socitety of Veterinary Service.
홍세림ㆍ강혜정ㆍ문진산ㆍ윤순식ㆍ김하영*
농림축산검역본부 세균질병과
Serim Hong , Hye Jeong Kang , Jin-San Moon , Soon-Seek Yoon , Ha-Young Kim *
Bacterial Disease Division, Animal and Plant Quarantine Agency, Gimcheon 39660, Korea
Correspondence to:Ha-Young Kim
E-mail: kimhy@korea.kr
https://orcid.org/0000-0002-1332-3832
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0). which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
We investigated the virulence genes, O-serotypes, antimicrobial resistance of pathogenic E. coli isolated from carcasses (n=455) and environmental (n=372) samples of 11 cattle and 12 pig slaughterhouses from December 2020 to December 2021. E. coli were isolated from nine carcasses (2.0%), three slaughter facilities (1.4%), two utensils (2.7%) and three abattoir workers (3.5%) from four cattle and four pig slaughterhouses. Among all isolates, 13 STEC (76.5%) were identified, followed by four EPEC (23.5%). As a result of the antibiotic susceptibility test, all isolates were resistant to at least one antimicrobial, of which 70.6% isolates showed multidrug resistance patterns. The serotypes were diverse in pigs compared to cattle, with serotypes O18, O66, O109 in cattle and O9, O76, O85, O100, O153, and O159 in pigs. In a single cattle slaughterhouse, eight STEC O66 were isolated from various types of sample (4 slaughter animal surfaces, 3 gloves, and 1 knife) with two antimicrobial resistance patterns (CHL-FIS-STR and CHL-FIS). Those two types of strain were suspected crosscontamination from utensils to slaughter animal surfaces. These results showed that pathogenic E. coli were detected in carcasses and various environmental samples in cattle and pig slaughterhouses. Nationwide monitoring and hygiene management are required to prevent cross-contamination of STEC isolate slaughterhouses.
Keywords: Cattle, Pig, Slaughterhouse, Pathogenic Escherichia coli
병원성 대장균은 독소생성과 부착인자의 생산 유무, 임상증상 등에 따라 장병원성 대장균(Enteropathogenic
식중독의 주요 원인체 중 하나인 병원성 대장균은 오염된 식품이나 물의 섭취, 동물, 환자와의 접촉에 의한 감염, 도축 중 잘못된 가공 방법에 의해 가축의 배설물이 식육에 오염되었을 경우에 식중독을 일으킨다. 미국 질병통제예방센터(CDC)에서는 매년 STEC O157이 약 96,000건, STEC non-O157이 약 169,000건의 질병을 유발하는 것으로 추정했다(CDC, 2018). 유럽 질병통제예방센터(ECDC)에 따르면 29개 국가에서 2015년에서 2019년까지 매년 약 6,100∼8,600건의 STEC 감염사례가 보고되었고(ECDC, 2021), 일본 국립감염병연구소(NIID)에서는 2019년과 2020년에 걸쳐 매년 약 3,000건의 EHEC 감염사례를 보고하였다(Hibiya 등, 2022). 국내 식품의약품안전처 자료에 따르면 최근 10년간 주요 세균성 식중독 원인균 중 1위는 병원성 대장균으로 2021년도에는 총 30건, 585명의 환자가 발생하였으며, 전체 세균성 식중독의 26%를 차지하였다(MFDS, 2022).
외국의 여러 연구에 따르면 도축장 등 생산단계 식육에서도 병원성 대장균이 검출되고 있으며(Shinagawa 등, 2000; Tutenel 등, 2003; Hu 등, 2021), 이 병원체를 효율적으로 제어하기 위해 도축과정 중 식중독균을 모니터링하는 것은 안전한 식품 생산에 있어서 매우 중요하게 여겨지고 있다(Santos 등, 2017; Santos 등, 2018). 국내에서는 일부 특정 지역을 대상으로 유통 중인 닭고기, 소고기, 돼지고기에서의 병원성 대장균에 대한 연구는 수행된 바 있다(Kim 등, 2009; Lee 등, 2009; Cho 등, 2017; Lee 등, 2021). 하지만 전국 단위의 도축장 도체 및 작업시설, 도구, 작업자 등 환경 유래 병원성 대장균 검출에 대한 연구가 거의 없는 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 국내 소와 돼지 도축장 내 도체 및 환경 시료를 대상으로 병원성 대장균의 분포를 조사하고 분리주의 특성을 분석하여 보고하고자 한다.
2020년 12월부터 2021년 12월까지 전국의 9개 시·도에 소재한 소 도축장 11개소에서 채취한 380건(예냉실 도체 110건, 도축과정의 도체 95건, 시설 101건, 도구 34건, 작업자 40건) 및 돼지 도축장 12개소에서 채취한 447건(예냉실 도체 120건, 도축과정의 도체 130건, 시설 112건, 도구 40건, 작업자 45건) 총 827건의 시료를 대상으로 대장균 분리를 수행하였다.
도축장 예냉실과 도축과정의 소와 돼지 도체 시료는 식품공전(MFDS, 2020)의 방법으로 10 mL buffered peptone water (BPW; Difco BD, Sparks, MD)가 함유된 멸균 스폰지(Nasco, Fort Atkinson, WI, USA)를 이용하여 채취하였다. 환경 시료 부위는 작업장 시설(계류장, 개수대, 장기적출대, 배수구, 벽, 바닥), 예냉실(벽, 바닥), 작업자(장갑, 장화), 도구(칼, 톱)가 포함되었으며, 각 구역 간 오염이 가장 심한 것으로 생각되는 부위를 10×10 cm씩 약 100 cm2의 면적을 동일한 스폰지로 3부분 문질러서 시료 채취하였다. 시료는 24시간 이내에 냉장 상태로 운반하여 실험하였다.
병원성 대장균 분리는 식품공전 및 식중독 원인조사 시험법(MFDS, 2019)에 수록된 식중독 스크리닝 검사법을 일부 변형하여 실험하였다. 시료 채취한 멸균 스펀지에 BPW 30 mL을 넣어 스토마커(Stomacher 80, Biomaster, Seward, UK)로 30초간 균질화시킨 후 1 mL을 증균배지인 modified EC broth with novobiocin (Merck, Berlin, Germany)에 접종하여 37℃에서 18∼24시간 동안 배양하였다. 배양액 1 mL을 13,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 버리고 원심침사에 멸균 증류수 100 µL로 현탁 후 boiling 방법으로 얻은 것을 template DNA로 사용하였다. 식품공전에 수록된 실시간유전자검사법(Real-Time PCR)은 STEC (
분리된 병원성 대장균을 대상으로 Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2020) 및 National Antimicrobial Resistance Monitoring System (NARMS, 2021)의 기준에 따라 16종 항생제(amoxicillin/clavulanic acid, ampicillin, cefepime, cefoxitin, ceftazidime, ceftiofur, chloramphenicol, ciprofloxacin, colistin, gentamicin, meropenem, nalidixic acid, streptomycin, sulfisoxazole, tetracycline, trimethoprim/sulphamethoxazole)가 코팅된 KRNV5F Sensititre Panel (Trek Diagnistic Systems, Cleveland, OH, USA)을 사용하여 액체배지희석법으로 최소억제농도(Minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하였다. 항생제 감수성검사의 quality control 균주로는
혈청형 검사는 O-genotyping PCR법과 O-serotyping으로 동시에 실시하였다. O-genotyping PCR은 이전 연구에 따라 병원성 대장균 항혈청 185종(O14와 O57을 제외한 O1-O187)에 대하여
소, 돼지 도축장의 도체, 시설, 도구, 작업자로부터 분리된 병원성 대장균의 분리 현황은 Table 1과 같으며, Genelix™ Real-Time PCR과 일반 PCR법 간의 검출률에 있어서 동일한 결과를 확인할 수 있었다. 소 도축장 11개소 중 4개소(C, E, I, K)에서 11주(2.9%)의 병원성 대장균이 분리되었으며, 이 중 도체 시료는 도축과정 도체 5건(5.3%)과 예냉실 도체 1건(0.9%)에서 각각 분리되었다. 환경 시료는 작업장 시설에서 0.5% (1/101), 도구에서 2.9% (1/34), 작업자에서 7.5% (3/40)로 조사되었으며, 그중에서도 작업자가 사용하는 장갑에서 가장 높게 분리되었다. 이외에 계류장과 칼에서도 각각 검출되었다. 돼지 도축장에서는 12개소 중 4개소(M, N, U, W)에서 6주(1.3%)의 병원성 대장균이 분리되었다. 이 중 도체 시료는 도축과정 도체 2건(1.5%)과 예냉실 도체 1건(0.8%)에서 각각 분리되었다. 환경 시료는 작업장 시설에서 1.8% (2/112), 도구에서 2.5% (1/40)로 소 도축장에 비해 상대적으로 낮은 검출률을 보였다. 이외에 개수대, 장기적출대, 칼에서도 각각 검출되었다. 이와 같이 소, 돼지 도축장의 다양한 시료에서 병원성 대장균이 검출되었다. 이러한 결과는 국내에서 Lee 등(2021)이 광주지역에서 유통·판매되는 소고기에서 24.4% (82/335), Choi 등(2010)이 소매시장 돼지고기에서 18.6% (175/943), Lee 등(2009)이 육류 가공시설 및 판매점 쇠고기에서 4.1% (31/750), 돼지고기에서 14.6% (201/1350)의 검출률보다는 비교적 낮은 분리율을 나타내었다. 이러한 결과는 시료 채취 장소, 조사, 시기, 환경 여건, 균분리 방법의 차이에 의한 것으로 생각된다(Hong 등, 2009).
Table 1 . Isolation of pathogenic
Sampling site | Isolation from 11 cattle slaughterhouses | Total (%) (n=380) | Isolation from 12 pig slaughterhouses | Total (%) (n=447) | |||||||||||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
A (n=21) | B (n=21) | C (n=21) | D (n=21) | E (n=50) | F (n=56) | G (n=53) | H (n=50) | I (n=47) | J (n=20) | K (n=50) | L (n=21) | M (n=21) | N (n=21) | O (n=21) | P (n=27) | Q (n=57) | R (n=21) | S (n=64) | T (n=57) | U (n=59) | V (n=21) | W (n=57) | |||
Carcasses (n=455) | 6 (2.9) | 3 (1.2) | |||||||||||||||||||||||
Slaughter animal surface (n=225) | NT* | NT | NT | NT | 4 | NT | 1 | NT | 5 (5.3) | NT | NT | NT | NT | NT | NT | 1 | NT | 1 | 2 (1.5) | ||||||
Chilling room carcass (n=230) | 1 | 1 (0.9) | 1 | 1 (0.8) | |||||||||||||||||||||
Facilities (n=213) | 1 (1.0) | 2 (1.8) | |||||||||||||||||||||||
Lairage (n=50) | NT | NT | NT | NT | NT | NT | 1 | 1 (4.0) | NT | NT | NT | NT | NT | NT | NT | 0 | |||||||||
Slaughter sites | |||||||||||||||||||||||||
Sink (n=23) | 0 | 1 | 1 (7.7) | ||||||||||||||||||||||
Evisceration table (n=23) | 0 | 1 | 1 (8.3) | ||||||||||||||||||||||
Drain (n=23) | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||
Wall and floor (n=48) | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||
Chilling room | |||||||||||||||||||||||||
Wall and floor (n=46) | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||
Utensils (n=74) | 1 (2.9) | 1 (2.5) | |||||||||||||||||||||||
Knives (n=51) | 1 | 1 (4.3) | 1 | 1 (3.6) | |||||||||||||||||||||
Saw (n=23) | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||
Abattoir workers (n=85) | 3 (7.5) | 0 | |||||||||||||||||||||||
Gloves (n=62) | 3 | 3 (10.0) | 0 | ||||||||||||||||||||||
Boots (n=23) | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||
Total (%) | 1 (4.8) | 8 (16.0) | 1 (2.1) | 1 (2.0) | 11 (2.9) | 2 (9.5) | 1 (4.8) | 2 (3.4) | 1 (1.8) | 6 (1.3) |
*NT, not tested..
분리된 17개의 병원성 대장균 중 STEC이 13주(76.5%),
Table 2 . Pathotypes of
Source | No. of samples | No. of isolates (%) | STEC (n=13) | EPEC (n=4) |
---|---|---|---|---|
Cattle | ||||
Carcasses | 205 | 6 (2.9) | 6 | 0 |
Environment | 175 | 5 (2.9) | 4 | 1 |
Pigs | ||||
Carcasses | 250 | 3 (1.2) | 1 | 2 |
Environment | 197 | 3 (1.5) | 2 | 1 |
STEC, Shiga toxin-producing
분리된 병원성 대장균에 대한 항생제 내성은 소 유래의 STEC은 CHL (100%), FIS (90.0%), STR (70.0%)에서만 내성을 보였고 EPEC은 CHL, FIS, STR, SXT에서 100% 내성을 보였다(Fig. 1). 돼지 유래의 STEC은 CHL (100%), FIS (66.7%), SXT (66.7%)에서 높은 내성을 보였고, EPEC은 CHL (100%), TET (100%), FIS (100%), STR (66.7%), AMP (66.7%)에서 높은 내성을 나타냈다. AmC, FOX, CAZ, XNL, CIP, GEN, NAL은 돼지 유래의 STEC에서만 33.3% 정도의 내성을 보였다. 이러한 결과는 국내에서 Kim 등(2013)이 서울지역에서 유통 중인 소고기와 돼지고기에서 조사된 결과와 유사한 것으로 나타났다. 국내산 축산물에서 대장균을 분리하여 항생제의 내성률을 조사한 결과, 소고기 유래 대장균은 모든 항생제에 대하여 30% 미만으로 낮게 나타났지만, 돼지고기 유래 대장균은 AMP, FIS, CHL, STR, TET은 60% 이상의 균주에서 내성률을 보이는 결과와 유사한 것으로 나타났다(APQA, 2020).
항생제 다제 내성 분포 양상을 조사한 결과, 모든 균주는 한 가지 이상의 항생제에 내성을 나타냈으며, 3종류 이상의 항생제에 내성을 가지는 다제 내성균은 분리주의 70.6%로 총 6가지 양상으로 확인되었다(Table 3). 병원형별 다제 내성률은 STEC의 경우 소에서 70.0% (7/10), 돼지에서 33.3% (1/3)인 반면, EPEC은 소와 돼지에서 분리된 4주 모두 다제 내성을 나타냈으며 유형도 모두 다르게 나타났다. 이러한 결과는 Kim 등(2014)이 학교급식에서 병원성 대장균의 다제 내성은 EPEC과 EAEC에만 있었고 EPEC에서 다제 내성의 유형이 다양하다고 보고한 결과와는 다른 양상을 보이는 것으로 나타났다.
Table 3 . Characterization of pathogenic
Animal | Slaughter-house name | Sampling sites | No. of isolates | Pathotype | Virulence factor | Serotype | Resistance pattern |
---|---|---|---|---|---|---|---|
Cattle (n=11) | C | Chilling room carcass | 1 | STEC | O66 | CHL-FIS-STR (MDR) | |
E | Slaughter animal surface | 3 | STEC | O66 | CHL-FIS-STR (MDR) | ||
E | Gloves | 2 | STEC | O66 | CHL-FIS-STR (MDR) | ||
E | Knife | 1 | STEC | O66 | CHL-FIS-STR (MDR) | ||
E | Slaughter animal surface | 1 | STEC | O66 | CHL-FIS | ||
E | Gloves | 1 | STEC | O66 | CHL-FIS | ||
I | Slaughter animal surface | 1 | STEC | O109 | CHL | ||
K | Lairage | 1 | EPEC | O18 | CHL-STR-FIS/SXT (MDR) | ||
Pigs (n=6) | M | Evisceration table | 1 | STEC | O9 | AmC-AMP-FOX-CAZ/XNL-CHL-CIP-NAL-FIS/SXT (MDR) | |
M | Sink | 1 | EPEC | O85 | CHL-FIS-STR-TET (MDR) | ||
N | Chilling room carcass | 1 | EPEC | O153 | AMP-CHL-STR-FIS/SXT-TET (MDR) | ||
U | Slaughter animal surface | 1 | STEC | O159 | CHL-GEN/STR | ||
U | Knife | 1 | STEC | O100 | CHL-FIS/SXT | ||
W | Slaughter animal surface | 1 | EPEC | O76 | AMP-CHL-FIS-TET (MDR) |
CHL, Chloramphenicol; FIS, Sulfisoxazole; STR, Streptomycin; SXT, Trimethoprim/Sulphamethoxazole; AMP, Ampicillin; TET, Tetracycline; AmC, Amoxicillin/Clavulanic Acid; FOX, Cefoxitin; CAZ, Ceftazidime; XNL, Ceftiofur; CIP, Ciprofloxacin; GEN, Gentamicin; NAL, Nalidixic Acid..
MDR, multidrug resistance (resistant to at least three antimicrobial subclasses)..
분리된 병원성 대장균 17주에 대한 혈청형을 O-genotyping PCR법과 O-serotyping으로 확인했을 때 동일한 결과를 얻었으며, 돼지에서 분리 균주 수에 비해 다양한 혈청형이 확인되는 등 축종별로 차이가 있었다. 소에서는 O18 (1주, 9.1%), O66 (9주, 81.8%), O109 (1주, 9.1%) 총 3종이 확인되었고 돼지에서는 O9, O76, O85, O100, O153, O159가 각 1주씩 총 6종의 혈청형이 확인되었다(Table 3). 미국, 유럽, 일본 등에서 non-O157 STEC 감염의 약 70%는 O26, O45, O91, O103, O111, O113, O121, O128, O145 혈청형에 의해 발생된다고 보고된 바 있다(CDC, 2018; NIID, 2020; Panel 등, 2020). 하지만 본 연구에서는 이러한 혈청형이 확인되지 않았다. 국내 분리 식육 유래 병원성 대장균의 주요 혈청형은 Park 등(2015)이 도축장 및 소매시장 소고기에서 O55, O126, 돼지고기에서 O1, O27, O55, O86, O114, O168이었으며, Lee 등(2009)이 육류 가공시설 및 판매점 소고기에서 O8, O18, O86, O119, O136, 돼지고기에서 O128이 확인됨에 따라 국내 식육에서는 다양한 유형의 혈청형이 분포되고 있을 것으로 추정된다.
본 연구에서
위의 연구결과를 종합해 볼 때 국내 소, 돼지 도축장에서 병원성 대장균의 경우 STEC과 EPEC만 많이 검출되었고, 다양한 혈청형이 분리되었지만, 일부 도축장에서 동일한 유형의 병원형과 혈청형이 존재하여 교차오염 가능성이 제기되었다. 향후 좀 더 많은 도축장을 대상으로 PFGE (pulsed-field gel electrophoresis)나 sequence-based typing 기술을 이용하여 분자역학적 분석을 통한 병원성 대장균에 대한 오염경로 구명이 필요할 것으로 생각된다.
2020년 12월부터 2021년 12월까지 전국 9개 시·도에 소재하는 소 도축장 11개소, 돼지 도축장 12개소의 도체 455건 및 환경 시료 372건에서 병원성 대장균을 분리하고 특성을 조사하였다. 병원성 대장균은 소 도축장 4개소, 돼지 도축장 4개소에서 도체 시료 9건(2.0%), 작업장 시설 3건(1.4%), 도구 2건(2.7%), 작업자에서 3건(3.5%) 분리되었다. 17개 분리주의 병원형 분포는 STEC 76.5% (13/17) 및 EPEC 23.5% (4/17)로 확인되었으며, EHEC, ETEC, EAEC 및 EIEC는 검출되지 않았다. 항생제 감수성 검사 결과 모든 균주는 한 가지 이상의 항생제에 내성을 보였으며, 3종류 이상의 항생제에 내성을 가지는 다제 내성균은 분리주의 70.6%로 총 6가지 양상으로 확인되었다. 혈청형을 축종별로 분류한 결과, 소에서는 O18 1주, O66 9주, O109 1주 총 3종이 확인되었고, 돼지에서는 O9, O76, O85, O100, O153, O159가 각 1주씩 총 6종의 혈청형이 확인되었다. 소 도축장 E에서는 도축 중 도체 표면(4주), 장갑(3주), 칼(1주)에서 분리된 병원성 대장균은 모두 STEC O66으로 확인되었으며, 항생제 내성 패턴이 CHL-FIS-STR인 균주들은 장갑과 칼에서 도체 표면으로, CHL-FIS인 균주들은 장갑에서 도체 표면으로 교차오염이 의심되었다. 이 연구를 통하여 소 및 돼지 도축장의 도체와 다양한 환경에 대한 병원성 대장균의 오염이 확인된 바, 이와 같은 병원성 대장균의 효과적인 관리를 위해서 도축장 환경에서의 오염원 차단 및 교차오염이 발생하지 않도록 모니터링 및 위생관리가 더욱 강화되어야 할 것으로 생각된다.
본 연구는 농림축산검역본부의 농림축산검역검사기술개발사업(과제명: 도축장 내 클로스트리듐과 예르시니아균 오염실태 및 특성조사, B-1543081-2022-23-02)의 연구비 지원에 의해 수행되었다.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
Table 1 . Isolation of pathogenic
Sampling site | Isolation from 11 cattle slaughterhouses | Total (%) (n=380) | Isolation from 12 pig slaughterhouses | Total (%) (n=447) | |||||||||||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
A (n=21) | B (n=21) | C (n=21) | D (n=21) | E (n=50) | F (n=56) | G (n=53) | H (n=50) | I (n=47) | J (n=20) | K (n=50) | L (n=21) | M (n=21) | N (n=21) | O (n=21) | P (n=27) | Q (n=57) | R (n=21) | S (n=64) | T (n=57) | U (n=59) | V (n=21) | W (n=57) | |||
Carcasses (n=455) | 6 (2.9) | 3 (1.2) | |||||||||||||||||||||||
Slaughter animal surface (n=225) | NT* | NT | NT | NT | 4 | NT | 1 | NT | 5 (5.3) | NT | NT | NT | NT | NT | NT | 1 | NT | 1 | 2 (1.5) | ||||||
Chilling room carcass (n=230) | 1 | 1 (0.9) | 1 | 1 (0.8) | |||||||||||||||||||||
Facilities (n=213) | 1 (1.0) | 2 (1.8) | |||||||||||||||||||||||
Lairage (n=50) | NT | NT | NT | NT | NT | NT | 1 | 1 (4.0) | NT | NT | NT | NT | NT | NT | NT | 0 | |||||||||
Slaughter sites | |||||||||||||||||||||||||
Sink (n=23) | 0 | 1 | 1 (7.7) | ||||||||||||||||||||||
Evisceration table (n=23) | 0 | 1 | 1 (8.3) | ||||||||||||||||||||||
Drain (n=23) | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||
Wall and floor (n=48) | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||
Chilling room | |||||||||||||||||||||||||
Wall and floor (n=46) | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||
Utensils (n=74) | 1 (2.9) | 1 (2.5) | |||||||||||||||||||||||
Knives (n=51) | 1 | 1 (4.3) | 1 | 1 (3.6) | |||||||||||||||||||||
Saw (n=23) | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||
Abattoir workers (n=85) | 3 (7.5) | 0 | |||||||||||||||||||||||
Gloves (n=62) | 3 | 3 (10.0) | 0 | ||||||||||||||||||||||
Boots (n=23) | 0 | 0 | |||||||||||||||||||||||
Total (%) | 1 (4.8) | 8 (16.0) | 1 (2.1) | 1 (2.0) | 11 (2.9) | 2 (9.5) | 1 (4.8) | 2 (3.4) | 1 (1.8) | 6 (1.3) |
*NT, not tested..
Table 2 . Pathotypes of
Source | No. of samples | No. of isolates (%) | STEC (n=13) | EPEC (n=4) |
---|---|---|---|---|
Cattle | ||||
Carcasses | 205 | 6 (2.9) | 6 | 0 |
Environment | 175 | 5 (2.9) | 4 | 1 |
Pigs | ||||
Carcasses | 250 | 3 (1.2) | 1 | 2 |
Environment | 197 | 3 (1.5) | 2 | 1 |
STEC, Shiga toxin-producing
Table 3 . Characterization of pathogenic
Animal | Slaughter-house name | Sampling sites | No. of isolates | Pathotype | Virulence factor | Serotype | Resistance pattern |
---|---|---|---|---|---|---|---|
Cattle (n=11) | C | Chilling room carcass | 1 | STEC | O66 | CHL-FIS-STR (MDR) | |
E | Slaughter animal surface | 3 | STEC | O66 | CHL-FIS-STR (MDR) | ||
E | Gloves | 2 | STEC | O66 | CHL-FIS-STR (MDR) | ||
E | Knife | 1 | STEC | O66 | CHL-FIS-STR (MDR) | ||
E | Slaughter animal surface | 1 | STEC | O66 | CHL-FIS | ||
E | Gloves | 1 | STEC | O66 | CHL-FIS | ||
I | Slaughter animal surface | 1 | STEC | O109 | CHL | ||
K | Lairage | 1 | EPEC | O18 | CHL-STR-FIS/SXT (MDR) | ||
Pigs (n=6) | M | Evisceration table | 1 | STEC | O9 | AmC-AMP-FOX-CAZ/XNL-CHL-CIP-NAL-FIS/SXT (MDR) | |
M | Sink | 1 | EPEC | O85 | CHL-FIS-STR-TET (MDR) | ||
N | Chilling room carcass | 1 | EPEC | O153 | AMP-CHL-STR-FIS/SXT-TET (MDR) | ||
U | Slaughter animal surface | 1 | STEC | O159 | CHL-GEN/STR | ||
U | Knife | 1 | STEC | O100 | CHL-FIS/SXT | ||
W | Slaughter animal surface | 1 | EPEC | O76 | AMP-CHL-FIS-TET (MDR) |
CHL, Chloramphenicol; FIS, Sulfisoxazole; STR, Streptomycin; SXT, Trimethoprim/Sulphamethoxazole; AMP, Ampicillin; TET, Tetracycline; AmC, Amoxicillin/Clavulanic Acid; FOX, Cefoxitin; CAZ, Ceftazidime; XNL, Ceftiofur; CIP, Ciprofloxacin; GEN, Gentamicin; NAL, Nalidixic Acid..
MDR, multidrug resistance (resistant to at least three antimicrobial subclasses)..
Kim, Yong-Hwan;Park, Jong-Tae;Kim, Jae-Ik;Kim, Hyun-Joong;Kim, Tae-Soon;Jang, Mi-Sun;Kim, Jeong-Nam;Park, Duk-Woong;Bae, Seong-Yeol;Park, Ja-Yoon;Seo, Eun-Ju;
Korean J. Vet. Serv. 2008; 31(2): 207-217 https://doi.org/10.7853/.2008.31.2.207Bo-Mi Moon, Keum-Sook Chu, Seung-Chai Kim, Hwan-Ju Kim, Da-Jeong Kim, Won-Il Kim
Korean J. Vet. Serv. 2023; 46(4): 315-324 https://doi.org/10.7853/kjvs.2023.46.4.315