Korean Journal of
Veterinary Service

돼지에서 증식성 괴사성 폐렴(proliferative and necrotizing pneumonia; PNP)은 간질성 폐렴의 한 유형으로 1988년 캐나다 Quebec주에서 최초로 보고되었다(Morin 등, 1990). PNP는 주로 4∼16주령의 이유자돈 또는 육성돈에서 심각한 호흡기 문제를 일으키는 것으로 알려져 있으며, 주요 임상증상으로는 발열, 호흡곤란, 다호흡 또는 복식호흡 등을 나타내고 때로 간헐적인 기침을 보인다(Dea 등, 1992). 육안적으로 폐장은 미만성으로 적색 또는 회색조로 발적되고 습윤하며, 퇴축이 불량하여 고무와 같은 경도를 나타낸다. 소엽간 결합조직은 수종성 비후를 보인다. 또한 단면 절개 시 표면이 돌출되고, 폐실질은 건조하여 흉선과 유사한 형태를 나타낸다(Morin 등, 1990). 병리조직학적으로 제 2형 폐포상피세포의 증식과 비후, 폐포강 내 염증세포의 괴사를 주된 특징으로 하는 간질성 폐렴을 나타낸다(Larochelle 등, 1994; Drolet 등, 2003; Grau-Roma와 Segalés, 2007). 기타 병변으로 폐포강 내에 장액성 삼출물 석출, 유리질막(hyaline membrane) 형성, 폐포벽에 단핵구의 침윤, 기관지 혹은 세기관지의 괴사, 다핵거대세포의 출현 등이 일부 예에서 관찰되기도 하였다(Morin 등, 1990; Austin 등, 1991).

PNP의 원인체로는 다양한 바이러스들이 관여하는 것으로 알려져 왔다. 처음 본 질병이 알려지면서 1990년대 초반까지 연구에서는 돼지 인플루엔자 바이러스(Swine influenza virus; SIV) type A가 PNP를 유발하는 것으로 보고되었다(Morin 등, 1990; Austin 등, 1991; Dea 등, 1992; Rekik 등, 1994). 이후 캐나다 및 이탈리아의 연구자들은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus; PRRSV)가 주요 원인체라 보고하였다(Larochelle 등, 1994; Magar 등, 1994; Drolet 등, 2003; Morandi 등, 2010). 또한 이탈리아에서는 PNP 병변에서 PRRSV뿐만 아니라 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2; PCV2)의 혼합감염이 빈번하게 나타나고 있음을 보고하였다(Morandi 등, 2010). 최근 PNP 병변에서 괴사성 폐렴을 유발할 수 있는 돼지 오제스키병 바이러스(Aujeszky’s disease virus; ADV)를 비롯한 호흡기 질병 바이러스를 조사한 스페인과 헝가리의 연구 결과 PCV2가 PNP를 유발하는 주된 원인체임이 보고되기도 하였다(Grau-Roma와 Segalés, 2007; Szeredi와 Szentirmai, 2008). 따라서 돼지에서 PNP를 유발하는 병원체는 지역별 및 연구 대상별로 상당한 차이가 있음을 알 수 있다.

현재까지 국내에서는 PNP의 발생 상황 및 원인체에 대한 조사는 거의 전무한 실정이다. 따라서 본 연구는 제주도 돼지를 대상으로 PNP 발생을 조사하고, PNP의 병변에서 PRRSV, PCV2, SIV, ADV의 존재유무를 확인하고자 수행하였다.

공시재료

2008년부터 2010년 5월까지 제주도 소재 양돈 농장으로부터 제주대학교 수의과대학 병리학교실에 병성감정 의뢰된 4∼15주령의 돼지 183두 중 병리조직학적으로 PNP의 소견을 보이는 폐장 시료 50두를 실험에 공여하였다.

병리조직학적 검사

의뢰된 돼지는 일반적인 절차에 따라 부검을 수행하고 폐장을 채취하여, 10% 중성완충포르말린에 고정하였다. 고정된 조직은 통상적인 처리과정에 따라 파라핀 포매 후 3∼4 μm로 절편을 제작하여 hematoxylin-eosin (H&E) 염색을 하였다.

PCR

검사 시료의 핵산 추출

돼지 50두의 폐장에서 DNA 바이러스인 ADV를 검출하기 위하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 과 RNA 바이러스인 SIV H1N1, H1N2 및 H3N2를 검출하기 위하여 N1, N2에 대한 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR; RT-PCR)을 실시하였다. 유전자 검사를 위하여 −70℃에 냉동 보관된 폐장 조직의 일부를 채취하여 DNase RNase free distilled water (Invitrogen, Carlsbad, USA)와 1:10 비율로 혼합하여 균질화시킨 후 상층액을 이용하였다.

DNA추출은 G-spin™ DNA extraction kit (iNtRON biotechnology, Suwon, Korea)를 이용하였다. 시료의 상층액 200 μL에 G-buffer 400 μL을 잘 혼합한 다음 70℃에서 10분간 방치하고 binding buffer 400 μL를 첨가하여 column에 800 μL를 넣고 12,000 rpm에서 1분간 원심분리하였다. 여과된 용액을 제거하고 Collection tube에 500 μL의 washing buffer를 분주하여 12,000 rpm에서 1분간 원심분리한 후 상기 과정을 1회 반복하였다. 새로운 1.5 mL effendorf tube에 column을 넣고 100 mL의 elution buffer를 첨가하여 13,000 rpm에서 1분간 원심분리를 하였다. 최종 추출물은 PCR검사 전까지 −70℃에서 냉동보관 하였다.

RNA의 추출은 RNeasy^® Protect Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하였다. 유제액 200 μL와 RLT buffer 350 μL를 혼합한 후, 70% ethanol 350 μL을 첨가하여 Mini column에 700 μL의 반응액을 넣고 4℃, 10,000 rpm에서 30초간 원심분리 하였다. Collecting tube내 용액을 제거하고 column에 RW1 buffer 700 μL을 분주한 후 4℃, 10,000 rpm으로 다시 30초간 원심분리 하였다. Column에 용액이 남지 않도록 4℃, 12,000 rpm에서 1분간 다시 원심분리한 후 column을 새로운 1.5 mL effendorf tube에 넣고 RNase free water를 40 μL 분주하여 4℃, 12,000 rpm으로 1분간 원심분리 하였다. 최종 추출물은 RT-PCR 검사를 실시하기 전까지 − 70℃에서 냉동보관 하였다.

Oligonucleotide primer의 제작

ADV 검출을 위한 primer는 Lee 등(2002)의 방법에 준하여 제작하였으며, SIV N1, N2의 검출을 위한 primer는 Choi 등(2002)이 제시한 염기서열에 준하여 제작하였다.

PCR 반응조건

ADV의 검출을 위한 반응조건은 추출한 DNA 2 μL와 ADV의 primer 각각 0.5 μL (20 pmol) 및 DNase RNase free water 17 μL를 PCR premix (Maxime PCR premix, iNtRON biotechnology, Suwon, Korea)에 첨가하여 최종 반응 용량이 20 μL가 되도록 하였다. ADV는 94℃에서 5분간 반응한 다음 94℃, 65℃ 및 72℃에 각각 45초, 30초, 45초씩 30회 반복하고 최종 72℃에서 10분간 반응하였다. 핵산의 증폭은 PCR Thermal Cycler Dice TP600 (TaKaRa, Chiba, Japan)을 이용하였다.

RT-PCR 반응조건

SIV N1, N2의 검출을 위한 반응조건은 추출한 RNA 2 μL와 검출하고자 하는 바이러스의 primer를 각각 0.5 μL (20 pmol) 및 DNase RNase free water 17 μL를 RT-PCR premix (Maxime RT-PCR premix, iNtRON biotechnology, Suwon, Korea)에 첨가하여 최종 반응 용량이 20 μL가 되도록 하였다. SIV는 95℃에서 15분간 반응한 다음, 95℃, 60℃ 및 72℃에 각각 1분, 30초, 1분씩 30회 반복하고 최종 72℃에서 10분간 반응하였다. 핵산의 증폭은 PCR Thermal Cycler Dice TP600 (TaKaRa, Chiba, Japan)을 이용하였다

PCR 증폭산물의 확인

반응 종료 후, 각각의 반응액 7 μL를 1.5% agarose gel상에서 전기영동을 실시한 다음, ethidium bromide 용액(0.5 μL/mL in DW)으로 염색하였다. UV transilluminator (Mupid-Scope WD, TaKaRa, Chiba, Japan)로 각각의 병원체에 대한 특이적인 밴드유무를 확인하였으며, 증폭산물의 크기를 확인하기 위하여 100 bp DNA Ladder (iNtRON biotechnology, Suwon, Korea)를 molecular size marker로 이용하였다.

면역조직화학염색

선정된 돼지의 폐장에서 PCV2 및 PRRSV 항원의 분포를 확인하기 위하여 Envision polymer reagent (Dako, Carpinteria, USA) 방법으로 IHC를 수행하였다. 폐장 파라핀 조직을 4 μm 두께로 절편하여 silane 코팅 슬라이드에 부착한 후, 탈파라핀 및 함수과정을 거쳤으며, 조직 내 존재하는 endogenous peroxidase를 제거하기 위해 3% H₂O₂가 첨가된 phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2)에 10분간 반응시켰다. 바이러스를 확인하기 위한 1차 항체로는 rabbit anti-PCV2 antibody 및 mouse anti-PRRSV (SDOW17) antibody를 사용하였다. 이들 항체를 조직위에 적하하여 37℃에서 1시간 처리한 다음 2차 항체에 40분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 PBS 수세를 거쳐 3, 3’-diamino-benzidine tetrahydrochloride (DAB; Dako, Carpinteria, USA)로 발색하였으며, 대조염색은 Mayer hematoxylin (Sigma, St Louis, USA)으로 염색하였다. 염색이 끝난 조직 슬라이드는 광학현미경으로 관찰하여 바이러스 항원의 유무 및 조직내 분포를 확인하였다.

육안검사 결과

육안적으로 PNP 병변을 가지고 있는 폐장은 정상에 비하여 발적, 종창되어 적색조 혹은 회색조를 띠었다. 또한 전반적으로 퇴축이 불량하며 고무와 같은 경도를 나타내고 있었다(Fig. 1A). 일부 폐장은 전복측엽에 자적색 또는 담적색의 경화소가 동반되어 관찰되기도 하였다(Fig. 1B).

Figure 1. Gross lesions of proliferative and necrotizing pneumonia. Fail to collapsed lung with rubbery consistency and red to gray color (A). Cranio-ventral pulmonary consolidation with interstitial edema (B).

병리조직학적 검사 결과

병리조직학적 검사결과, 50두 폐장에서는 제 2형 폐포상피세포의 증식과 비대를 동반한 간질성 폐렴이 관찰되었고 폐포벽은 림프구, 큰포식세포의 침윤으로 비후되어 있었다. 또한 폐포강내에는 다양한 정도의 부종과 큰포식세포의 침윤, 호염성 또는 호산성의 과립 파편을 함유한 괴사 세포들이 관찰되었다(Fig. 2). 화농성 기관지성 폐렴(60%, 30/50), 기관지 및 세기관지 상피세포의 괴사(28%, 14/50), 섬유소성 흉막염(22%, 11/50)의 병변이 관찰되기도 하였다. 또한 일부 개체의 폐장에서는 기관지관련림프조직(bronchus-associated lymphoid tissue: BALT)의 증식 및 기관지 또는 세기관지 주위로 결합조직의 증식이 나타나기도 하였다.

Figure 2. Histologic features of proliferative and necrotizing pneumonia. Affected alveoli are lined by proliferated type 2 pneumocytes (arrows). Many necrotic inflammatory cells (arrowheads) are occupied in the alveolar lumen. H&E. Bar=20 µm.

PCR 및 RT-PCR 결과

50두의 폐장에 대한 ADV 및 SIV 유전자 검사결과 전 두수 음성으로 판명되었다.

면역조직화학 검사 결과

조직 내 PRRSV 및 PCV2 항원분포 조사

PRRSV와 PCV2에 대한 IHC를 이용한 폐장 내 항원 검출 결과는 Table 1과 같다. 항원이 검출된 개체는 50두 중 44두로 88%의 양성률을 보였으며 PRRSV는 50두 중 38두에서 양성을 보였고(76%), PCV2는 25두에서 양성을 보였다(50%). 감염 유형을 보면 PRRSV 단독 감염이 38% (19/50), PCV2 단독감염이 12% (6/50), 두 바이러스 혼합감염이 38% (19/50)로 확인되었다. 그러나 6두에서는 바이러스 항원이 검출되지 않았다.

Table 1 . Detection rate of viral antigens in 50 porcine lungs with PNP lesions.

Virus	Number of positive	%
PRRSV only	19	38
PCV2 only	6	12
PRRSV+PCV2	19	38
None	6	12
Total	50	100

PRRSV, porcine reproductive and respiratory syndrome virus; PCV2, porcine circovirus type 2..

PRRSV 및 PCV2 바이러스 항원의 분포를 분석한 결과, PRRSV 는 국소에서 다병소성 또는 미만성 분포까지 다양하게 나타났으며, 폐포강 또는 폐포벽의 폐포 큰포식세포의 세포질 및 폐포강 내 괴사세포 무리에서 공히 검출되었다(Fig. 3A). 반면 PCV2 항원은 대부분 다병소성에서부터 미만성의 분포를 나타내었다. 항원은 PRRSV와 유사하게 폐포강 및 폐포벽의 폐포 큰포식세포의 세포질과 폐포강 내 괴사세포 무리에서 공통적으로 검출되었으나(Fig. 3B) 일부의 개체에서는 BALT의 dendritic cells, 기관지 및 세기관지 상피세포, 기관지 주위 결합조직의 섬유모세포에서도 검출되었다.

Figure 3. Presence of PRRSV (A) and PCV-2 (B) antigens in necrotic cellular debris in alveolar lumens. IHC. Bar=20 µm.

돼지에서 호흡기 질병은 세균, 바이러스, 진균 및 기생충 등과 같은 감염성 요인, 환경적 요인, 사양 관리, 유전적 요인 등이 복합적으로 작용하여 발생한다(Christensen 등, 1999). 특히 양돈 산업의 규모가 커지고 밀집사육이 심화될수록 공기로 전파되는 호흡기 질병이 전 세계적으로 가장 중요하고 심각한 문제로 부각되고 있는 실정이다.

본 연구에서는 제주도 소재 양돈장에서 의뢰된 183두의 돼지 중 병리조직학적 소견을 토대로 50두의 PNP를 나타내는 개체를 선정하여 실험에 공시하였다. 공시된 50두의 폐장에서는 기존의 연구에서 보고하였던 바와 같이 폐포벽의 제 2형 폐포상피세포의 증식과 비후, 폐포강 내 염증세포의 괴사가 공통적으로 관찰되었으며 병변의 정도는 경미한 수준부터 심한 수준까지 다양하게 관찰되었다. 일부 개체에서는 세기관지 주위 섬유모세포의 증식, 기관지 또는 세기관지 주위 림프여포의 증생, 폐포강 내 섬유소의 석출 또는 다핵거대세포의 출현 등이 관찰되기도 하였다.

1980년대 말 캐나다의 Quebec 주와 Manitoba 주의 양돈장에서 PNP가 발생하기 시작하면서 이러한 유형의 폐렴이 전 세계적으로 문제시 되었다(Morin 등, 1990). 다양한 나라에서 이 병변과 연관되는 병원체에 대한 연구가 수행되었는데, 나라별, 년도별로 약간의 다른 결과들을 보여주었다.

1992년, 1994년에 보고된 바에 따르면 PNP 의 주된 병원체는 새로운 변종의 SIV라고 하였다(Dea 등, 1992; Rekik 등, 1994). 그러나, 유사한 시기 캐나다에서 PNP에서 PRRSV를 검출하면서 PRRSV 감염과의 연관성을 제기하였다(Magar 등, 1994). Larochelle 등(1994)은 PNP 병변을 가지는 야외 시료 38두에 대한 포르말린 고정 폐장을 대상으로 IHC를 활용하여 바이러스 항원을 검사한 결과 28두에서 PRRSV가 검출된 반면 SIV는 단 1두에서만 검출되었다. 그러므로 SIV 보다는 PRRSV가 돼지에서 PNP 병변 형성에 좀 더 밀접한 관련성이 있음을 제시하였다. 반면 유럽의 스페인에서는 74두의 PNP 병변을 가지는 이유자돈을 대상으로 폐장 조직에서 PCV2, PRRSV, SIV 및 ADV 항원 또는 핵산을 모니터링한 결과 각각 85.1%, 44.6%, 4.1%, 1.4%로 검출되었음을 보고하였다(Grau-Roma 와 Segalés, 2007). 이 중 PCV2 단독감염은 39.1%, PRRSV 단독감염은 4.1%로 나타났으며, 나머지 46%의 폐장에서는 PCV2와 PRRSV를 비롯한 SIV 또는 ADV가 혼합 감염되어 있음을 제시하였다. 따라서 북미 지역과는 달리 유럽에서는 돼지 PNP 병변에 PCV2가 주된 병원체로 작용하고 있음을 주장한 바 있다.

본 연구에서는 PNP 병변을 가지고 있는 이유자돈 폐장 50점을 대상으로 PRRSV, PCV2, SIV 및 ADV 유전자 또는 항원을 검사하였다. SIV와 ADV는 전 두수 음성으로 확인된 반면 PRRSV 및 PCV2 단독감염은 각각 19두(38%) 및 6두(12%), 두 바이러스의 혼합감염이 19두(38%)로 나타났다. 전체적으로 PRRSV가 38두(76%)의 폐장에서 검출되어 PCV2 (25두, 50%)에 비해 높은 감염률을 보이고 있었다. 이와 같은 결과는 28두 돼지의 PNP 병변에서 PRRSV 단독 39.3% (11두), PCV2 단독 14.3% (4두), PRRSV와 PCV2 혼합감염 28.6% (8두)가 검출된 2010년 이탈리아 연구자들의 보고와 매우 유사한 상황임을 알 수 있었다(Morandi 등, 2010). 그러므로 제주에서는 돼지의 PNP 병변 형성에 있어서 PCV2보다 PRRSV가 더욱 밀접하게 관련되고 있음을 확인할 수 있었다. 이렇게 지역별로 결과가 다른 이유는 서로 상이한 PRRSV 또는 PCV2 병원성의 차이, 역학적 상황, 숙주의 질병 감수성, 환경 및 사양관리에서 기인하고 있는 것으로 알려져 있다(Halbur 등, 1996; Opriessnig 등, 2004). 본 실험에서 6두는 검사한 모든 바이러스에 음성반응을 나타내었는데 이러한 원인으로, 검사한 4가지 병원체 외에 다른 병원체가 개재했을 가능성, 병증의 진행정도에 따라 조직내 원인 바이러스 항원이 제거되었을 가능성, 실험과정에서의 오차 가능성 등을 완전히 배제할 수는 없었다. 검사대상 50두에 대한 병리조직학적 검사결과, PNP의 주된 소견 외에 일부 개체에서 BALT 증생의 소견이 관찰되어 Mycoplasma hyopneumoniae의 감염도 의심되었다. 그러나, 이 병원체는 PNP의 주된 원인체가 아니기 때문에 본 연구에서 검사 대상의 원인체 항목에는 포함시키지 않았다.

PNP 병변에서 폐장 내 PRRSV 와 PCV2 항원의 분포에 대한 기존 연구결과를 보면, PRRSV는 주로 비대된 폐포상피세포의 세포질에 분포하고 있었고, PCV2는 폐포벽 또는 폐포강 내 큰포식세포의 세포질에서 보다 강하게 양성반응을 보였다(Morandi 등, 2010). 본 연구에서의 IHC 검사결과, 두 바이러스 모두 폐포강 내 괴사되는 세포 및 폐포벽의 큰포식세포에서 주로 양성반응을 보였다. 반면, 증식된 제 2형 폐포상피세포에서는 유의적인 양성 반응을 확인할 수 없었다. 이러한 결과는 정확히 판단할 수는 없으나, 바이러스 주에 따른 병원성의 차이에 기인했을 것으로 사료된다.

본 연구를 통하여 제주도에서도 돼지의 호흡기 질병 중 PNP가 상당히 많이 발생하고 있음이 확인되었다. 또한 PCR 및 IHC 기법을 이용하여 검사한 결과 PNP 병변 형성에 PRRSV가 일차적으로 관여하고 PCV2가 혼합감염되어 병변을 증폭시키고 있는 것이 입증되었다. 따라서 PRRSV 및 PCV2 등과 같은 바이러스 감염에 의한 피해를 최소화하기 위하여 농가별로는 철저한 질병 예방 대책이, 범 도 차원에서는 악성 질병 청정화를 유지하기 위한 방역 정책이 조속한 시일 내에 마련되어야 할 것으로 사료된다.

This research was supported by the 2022 education, research and student guidance grant funded by Jeju National University.

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.