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Korean J. Vet. Serv. 2022; 45(1): 39-45

Published online March 30, 2022

https://doi.org/10.7853/kjvs.2022.45.1.39

© The Korean Socitety of Veterinary Service

국내 원유 세균수 검사장비 박토스캔 및 박토카운트의 보정식 재평가

김이슬ㆍ김진환ㆍ변영섭ㆍ박다솜ㆍ김하영ㆍ윤순식ㆍ문진산*

농림축산검역본부 세균질병과

Received: January 12, 2022; Revised: March 4, 2022; Accepted: March 17, 2022

Re-evaluation on conversion system of BactoScan and BactoCount for raw milk in South Korea

ESeul Kim , Jin-Hwan Kim , Yeong-Seob Byun , Dasom Park , Ha-Young Kim , Soon-Seek Yoon , Jin-San Moon *

Bacterial Disease Division, Animal and Plant Quarantine Agency, Gimcheon 39660, Korea

Correspondence to : Jin-San Moon
E-mail: moonjs727@korea.kr
https://orcid.org/0000-0003-1057-9450

Received: January 12, 2022; Revised: March 4, 2022; Accepted: March 17, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0). which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

The total bacteria count is significantly important factor for hygienic quality in raw milk. BactoScan FMTM and BactoCount IBCTM are the automated instruments for the determination of the total bacterial count in raw milk. They have been used after calibration by standard plate count (SPC) method in South Korea since 2000. It is necessary to re-evaluate for total bacterial counter according to the improvement of milk quality and the change of milk quality grade. Therefore, this study was evaluated the conversion mode of the two machines by SPC method. We collected 921 bulk-tank milk samples throughout the concentration range of 1,000∼1,000,000 CFU/mL from June 2020 to October 2021. As a result, when compared by the SPC value, there was a slight difference in total bacterial count in BactoScan below 10,000 CFU/mL and above 200,000 CFU/mL and in BactoCount above 100,000 CFU/mL, respectively. Therefore, the conversion factor for BactoScan and the conversion equation for BactoCount were newly adjusted based on SPC value, and then the correlation coefficients (R2) was 0.85 or higher. In addition, the correlation (R2) between BactoScan and BactoCount was 0.91, which means the results were high positive correlation. These results are expected to contribute to improving the accuracy of the automated instruments for determining of total bacterial count in raw milk.

Keywords BactoCount, BactoScan, Conversion system, Raw milk, Total bacterial count

젖소 원유의 미생물 오염은 유제품에 부정적인 영향을 미치게 되므로 원유의 일반세균수(total bacterial count) 검사는 우유의 생산과 저장과정 중의 위생 및 유질 상태를 평가하는 국제적인 지표로 널리 활용되고 있다(Desmeasures와 Gueguen, 1997). 우리나라에서는 1993년 6월 1일부터 고품질 원유생산을 위해 세균수에 의한 유대차등지급제를 실시해왔다. 그 후 원유의 위생 수준을 높이기 위하여 2016년에는 5개의 위생등급(1A, 1B, 2, 3, 4등급)으로 구분하여 현재까지 사용하고 있다. 이러한 제도 시행으로 인해 원유의 위생 수준이 지속적으로 향상되어 2020년에는 전체 원유의 99.41%가 세균수 1등급(10만 CFU/mL)을 나타내었다. 이에 비하여 3등급 이상(25만 CFU/ml)은 0.12%를 나타내었다(Kang 등, 2020; 농림축산검역본부, 2021).

세균 집락을 측정하는 방법인 표준평판배양법(standard plate count Method; SPC)은 전 세계적인 표준방법으로 이용되고 있다. 하지만 이 검사법은 검사 후 72시간이 경과한 후에야 결과를 알 수 있고, 많은 노동력이 필요하여 다량의 시료를 검사하는데 어려움이 있다(Bolzoli 등, 2017). 세균을 직접 계수하는 직접 현미경법은 15분 정도면 검사 결과를 얻을 수 있으므로 표준평판배양법에 비하면 신속하다. 하지만 생균과 사균을 모두 계수한 결과이며, 아주 적은 양의 시료를 취해야 하므로 실험 결과의 반복성이 떨어지고, 다량의 원유 중 세균수를 검사하기 어려워 원유의 미생물수를 측정하기 위한 일반적인 방법으로는 한계가 있다(농림축산검역본부, 2019).

박토스캔(BactoScan) 및 박토카운트(BactoCount) 등의 검사장비는 원유의 미생물을 형광 물질로 염색하여 형광현미경을 통해 연속적으로 세균을 세는 자동화된 미생물 계수장치이다. 이러한 세균수 검사장비는 검사 시작 후 신속하게 검사 결과를 알 수 있으므로 다량의 시료를 검사하는 데 많이 사용하나, 장비가 비싸고 생균과 사균이 동시에 측정된다는 단점이 있다(ISO, 2003; ISO, 2013; Walter와 Thomas, 2016; Bolzoli 등, 2017; Madden 등, 2017). 그러므로 이러한 장비들은 생균만을 측정하기 위하여 표준평판배양법에 기초하여 국가별 원유 세균수 위생등급 및 유질 수준을 고려한 보정식(coversion system)을 설정한 후 사용하고 있다(Cunningham 등, 1988; IDF, 1998; Gunasekera 등, 2000; Suhren과 Walte, 2000; Gunasekera 등, 2003; ISO, 2003, IDF, 2004; ISO/IDF, 2013; Madden 등, 2017).

우리나라에서도 국내 세균수 검사의 표준검사법인 표준평판배양법에 기초하여 박토스캔은 1993년과 2000년에 유대 지급 등급에 맞게 최소 200개 이상의 냉각기 집합유를 활용하여 15개의 세균수 구간(5천∼2백만 CFU/mL)에 대한 보정계수(conversion factor)를 설정하여 현재까지 사용하고 있다(농림축산검역본부, 2020). 박토카운트IBC의 경우에는 2019년에 국내 일부 원유검사실시기관, 집유장, 유가공장 등에 도입된 후 박토스캔FC 검사법에 기초하여 변환방정식(conversion equation)을 마련하여 유대지불 및 원유 품질 검사에 활용하고 있다(농림축산검역본부, 2021).

국내산 원유의 세균수 수준이 과거보다 향상되었고, 국내 위생 등급(3만∼50만 CFU/mL)의 변화에 따라 세균수 검사장비의 정확성을 향상시키기 위한 보정계수 또는 변환방정식에 대한 재평가가 필요한 실정이다. 이에 본 연구에서는 2020년부터 2021년까지 2년 동안 국내 목장 집합유를 대상으로 표준평판배양법과 박토스캔FC 및 박토카운트IBC 자동화장비와의 비교검사를 실시하여 보정식에 대한 평가를 수행하였다.

시료 및 실험설계

2020년 6월부터 2021년 10월까지 총 23회에 걸쳐 국내 세균수 위생등급 수준을 고려한 유대지불 세균수 검사를 위하여 경북동물위생시험소에 제공된 목장 집합유 1,200개 시료를 본 실험에 사용하였다. 경북동물위생시험소에서 박토스캔FC로 일차 검사를 완료한 시료 중 세균수 1천∼100만 CFU/mL의 시료들이 골고루 분포되도록 일일 50∼100개 정도의 시료를 선별한 후 농림축산검역본부 원유검사실에 냉장상태로 신속하게 운송하여 3가지 검사법으로 각각 1회씩 세균수 검사를 실시하였다. 2020년에는 표준평판배양법에 기초하여 박토스캔과 박토카운트의 현재 보정식에 대한 평가를 실시하기 위하여 600여개의 시료를 사용하였고 2021년에는 새롭게 설정한 보정식에 대한 검증 차원에서 600여개의 시료를 박토스캔과 박토카운트로 세균수 검사를 실시하였다.

세균수 검사

표준평판배양법 (Standard plate count)

원유 중 일반세균수 검사는 IDF Standard 100B(1991)에 기초하여 표준평판배양법으로 실시하였다. 즉, 채취한 원유 시료액 1 mL과 희석액(멸균생리식염수) 9 mL을 혼합한 후 10진 희석하여 각 단계 희석액(10−2, 10−3, 10−4)을 멸균 페트리디쉬 2매에 1 mL씩 무균적으로 주입하였다. 그 후 45℃로 유지한 표준한천평판배지 15 mL를 무균적으로 분주하고 천천히 회전하여 좌우로 기울이면서 시료와 배지를 잘 섞어 응고시킨다. 확산 집락의 발생을 억제하기 위하여 다시 표준한천배지 3∼5 mL를 가하여 중첩시킨 다음 응고시킨 페트리디쉬는 거꾸로 뒤집어 30℃에서 72시간 배양하였다. 배양 후 확산 집락이 없고 1개의 평판 당 15∼300개의 집락을 생성한 평판의 집락수를 계산하여 세균수를 측정하였다.

자동화장비(박토스캔 및 박토카운트)

박토스캔(BactoScan FC™, Fhoss Electric A/S Hillerod, Denmark)과 박토카운트(BactoCount IBC™, Bentley Instruments Inc., Chaska, USA)는 농림축산검역본부 세균질병과에 보유 중인 장비를 사용하여 제조회사에서 권장하는 방법대로 원유 중 세균수 검사를 실시하였다. 검사장비가 적정 운용 상태인지를 매 검사시마다 평가하기 위하여 농림축산검역본부 세균질병과에서 제조한 정도관리용 표준시료 3종(low 4만, medium 8만, high 16만 CFU/mL)을 매회 사용하여(Kang 등, 2020), 장비 내 허용오차 범위에 있는지를 확인한 후 원유 중 세균수 검사를 실시하였다.

통계 분석

표준평판배양법, 박토스캔, 박토카운트 장비를 이용하여 세균수를 CFU/mL 단위로 측정한 후 그 결과를 log 값으로 변환하였다. 보정계수 및 변환방정식 평가시 정확성을 높이기 위하여 3가지 결과값 중 1개 이상의 결과에서 0.4 log unit 이상의 차이를 보인 시료는 자료 분석시 제외하였다. 이러한 통계 분석에 사용된 시료수는 총 921개였으며, 측정된 세균수 구간별 시료수는 Table 1에서와 같이 10,000 CFU/mL 미만이 477개로서 전체의 51.8%로 가장 많았고 100,000 CFU/mL 초과가 97개(10.5%)로서 가장 적은 비율을 차지하였다. 이러한 세균수 측정 결과를 엑셀프로그램(Excel plus 2019; Microsoft Corp., Redmond, WA)을 활용하여 세균수 구간(3.0∼6.0 log unit CFU/mL)별로 일치도를 분석하였고 표준평판배양법과 자동화검사법간의 회귀분석 및 상관성을 분석하였다.

Table 1 . Distribution of raw milk samples used in this study by BactoScan FC method

Range of total bacterial count (CFU/mL)No. of samples (%)
<10,000477 (51.8)
10,000∼50,000272 (29.5)
50,000∼100,00075 (8.1)
>100,00097 (10.5)
Total921 (100)

표준평판배양법에 기초하여 박토스캔과 박토카운트의 현행 보정식에 대한 평가를 위하여 473개 시료에 대하여 세균수 구간별 일치도와 상관성을 분석하였다. 그 결과 표준평판배양법과 장비간 상관성(R2)에 있어서는 모두 0.85 이상으로 전체적으로 양호한 수준을 보였다. 하지만 Fig. 1에서와 같이 세균수 4.0 log unit 이하에서는 SPC 평균값에 비해 상대적으로 장비 측정값이 약간 높게, 세균수 5.0 log unit 이상에서는 SPC 평균값에 비하여 상대적으로 장비 측정값이 약간 낮게(0.07∼0.08 log unit) 형성되는 것으로 나타났다. 그리하여 SPC 세균수 평균값에 기초하여 Table 2에서와 같이 박토스캔의 경우에는 5천 CFU/mL 이하의 경우에는 1천 CFU/mL까지 측정될 수 있도록 보정계수를 추가로 신설하고, 5천∼20만 CFU/mL 구간은 기존과 동일하게, 20만∼100만 CFU/mL 구간은 변경하고, 100만 CFU/mL 이상의 구간은 삭제하였다.

Table 2 . Comparison of before and after adjustment of conversion factor in BactoScan FC

Section of bacterial countConversion factorRemark

CurrentNew


IBC*/mLCFU/mLIBC/mLCFU/mL
1--3,0001,000Foundation
222,0005,00022,0005,000Maintenance
337,0009,00037,0009,000
457,00020,00057,00020,000
574,00031,00074,00031,000
6103,00044,000103,00044,000
7149,00065,000149,00065,000
8184,00086,000184,00086,000
9235,000120,000235,000120,000
10372,000201,000372,000201,000
11548,000300,000548,000266,000Adjustment
12861,000429,000861,000365,000
131,402,000586,0001,477,000631,000
142,305,000866,0002,141,0001,018,000
154,318,0001,373,000--Delete
1612,963,0002,000,000--

*IBC: individual bacterial counts, CFU: colony-forming units.


Fig. 1.Comparison of trend of total bacterial count before (current) and after (new) the adjustment of conversion system of BactoScan FC and BactoCount IBC based on SPC (Standard plate count) method.

박토카운트의 경우에는 SPC 평균값에 기초하여 세균수 4.0∼6.0 log unit 구간에서 0.07∼0.08 log unit 값을 올리기 위하여 현행 변환방정식인 Log10*1.18005(IBC)−0.955679에서 Log10*1.18005(IBC)−0.875679으로 편차(bias) 값을 약간 조정하였다(Fig. 2). 보정식을 조정한 후 표준평판배양법과 장비간(박토스캔/박토카운트) 일치도와 상관성에서도 각각 0.8595, 0.8610으로 모두 0.85 이상으로 나타나 매우 양호한 수준을 보였다. 또한 4.0 log unit 이하와 5.0 log unit 이상의 세균수 구간의 일치율도 높아졌으며(Fig. 1), 박토스캔과 박토카운트 두 장비간 상관성(R2)은 변경 전(0.8599)에 비하여 변경 후 0.9134로 높아진 것으로 나타났다(Fig. 3).

Fig. 2.Adjustment of conversion equation (IBC→CFU) in BactoCount IBC <current; Log10*1.18005(IBC)−0.955679→new; Log10* 1.18005(IBC)−0.875679>.
Fig. 3.Comparison of regression between automatic bacterial counters and SPC method before (current) and after (new) the adjustment of conversion system of BactoScan FC and BactoCount IBC.

일반세균수는 시료 중에 존재하는 세균 중 표준한천배지 내에서 발육할 수 있는 중온균의 수를 말한다. 원유 중의 일반세균수 검사는 30±1℃에서 약 72시간 배양한 후 세균, 효모, 곰팡이 집락을 계수하여 측정하며 원유의 미생물학적 품질의 지표로서 전세계적으로 활용되고 있다(Regulation EC, 2004). 원유의 일반세균수 검사에 있어서 flow cytometry 기법에 기초한 박토스캔과 박토카운트 자동화 장비 또한 전세계적으로 유대지불 원유검사에 널리 활용되고 있다. 이러한 장비들은 각국의 세균수 위생등급 기준을 고려하여 목장 집합유를 이용해 일반세균수의 표준검사법인 표준평판배양법으로 보정된 후 사용되고 있다(ISO, 2013; Walter와 Thomas, 2016; Bolzoli 등, 2017; Madden 등, 2017).

영국, 이탈리아 등 유럽연합에서는 박토스캔 또는 박토카운트 장비에 대한 보정식 설정 후 위생등급 및 유질의 변화에 따라서 주기적으로 보완하여 사용하고 있다. 즉, 박토스캔의 경우에 3.8천∼49만 CFU/mL 구간에 15개의 보정계수를, 독일에서는 1만∼78만 CFU/mL 구간에 16개의 보정계수를, 스위스에서는 3천∼70만 CFU/mL 구간에 15개의 보정계수를 각각 설정하여 세균수 유대지불 검사에 활용하고 있다. 박토카운트의 경우에는 미국, 유럽, 일본, 브라질 등 14개 국가에서 공동으로 10년 동안 9,500개 시료를 활용하여 변환방정식을 설정한 후 세균수 검사에 활용하고 있다(ISO, 2003; ISO/IDF, 2004; Bolzoli 등, 2017; 농림축산검역본부, 2020).

국내의 경우에도 1993년 위생등급제가 시행된 후 박토스캔 8000 장비가 도입되어 표준평판배양법에 기초한 보정계수가 설정되어 원유검사에 사용되었다. 박토스캔 FC 장비가 2000년에 도입된 후에 박토스캔 8000 장비에 기초하여 설정된 보정계수가 현재까지 그대로 사용되고 있다. 국내산 원유의 세균수가 지속적으로 개선되고, 소비자의 고품질 우유 생산에 대한 요구로 1996년에는 4등급의 기준이 100만 CFU/mL 초과에서 50만 CFU/mL 초과로 변경되었다. 2010년에는 전체 생산된 원유의 0.1%가 50만 CFU/mL 이상을 나타냈으나, 2020년에는 전체 생산된 원유의 0.03%가 50만 CFU/mL 이상이었으며, 99.41%가 10만 CFU/mL 미만으로 생산되고 있다(농림축산검역본부, 2021). 일부 유업체에서는 세균수 최고 기준을 1만 CFU/mL 미만으로 적용하여 프리미엄 우유를 생산하고 있다. 이러한 유질개선 및 낙농산업 여건의 변화로 원유 세균수 검사장비의 보정계수 또는 변환방정식에 대한 재평가가 필요한 실정이다.

이에 본 연구에서는 국내 목장 집합유를 사용하여 표준평판배양법과 박토스캔FC 및 박토카운트IBC 장비 측정값과 비교검사를 실시한 바, 표준평판배양법과 장비간 상관성에 있어서는 모두 0.85 이상으로 양호한 수준을 보였다. 하지만, 세균수 4.0 log unit 이하에서는 SPC 평균값에 비해 상대적으로 장비 측정값이 0.07 log unit 이하의 범위에서 약간 높게 나타났다. 이에 비하여 세균수 5.0 log unit 이상에서는 SPC 평균값에 비하여 상대적으로 장비 측정값이 0.08 log unit 이하의 범위에서 전반적으로 낮게 나타났다. 이러한 결과는 세균수 검사장비의 반복성과 재현성의 권장기준(ISO 16140)이 각각 0.09 log 미만과 0.16 log 미만인 것을 고려할 때 두 장비간 세균수 차이는 매우 양호한 것으로 조사되었다(ISO, 2003). 하지만 국내 유대지불 기준인 4.0∼6.0 log unit 구간에서 박토스캔과 박토카운트 장비간 일치도를 더욱 높이기 위해서는 현행 보정계수 및 변환방정식에 있어서 1만 미만과 20만 이상의 세균수 범위에서 약간의 조정이 필요한 것으로 분석되었다.

따라서 본 연구에서는 이러한 목표 달성을 위하여 박토스캔의 경우에는 세균수 5천 CFU/mL 이하의 경우에는 1천 CFU/mL까지 측정될 수 있도록 보정계수를 추가로 신설하고, 20만∼100만 CFU/mL 구간은 변경하였다. 박토카운트의 경우에는 SPC 평균값에 기초하여 세균수 4.0∼6.0 log unit 구간에서 0.07∼0.08 log unit 값을 올리기 위하여 현행 변환방정식인 Log10*1.18005(IBC)−0.955679을 Log10*1.18005(IBC)−0.875679으로 편차를 약간 조정하였다. 그 결과 현행 보정식의 개선이 필요했던 4.0 log unit 이하와 5.0 log unit 이상의 세균수 구간에서 SPC 평균값과 박토스캔 및 박토카운트 측정값에 있어서 매우 일치한 결과를 확인할 수 있었다. 또한, 원유검사실시기관 및 유업체 등에서 실질적으로 사용하고 있는 박토스캔과 박토카운트 두 장비간 상관성(R2)에 있어서 변경 전(0.8599)에 비하여 변경 후 0.9134로 약간 높아진 것으로 확인 되었으며, 이러한 결과는 ISO의 권장기준인 0.80 이상을 만족한 것으로 평가되었다(ISO, 2003). 위의 연구결과를 종합해 볼 때 본 연구에서 2020년부터 2021년까지의 국내 집합유를 사용하여 표준평판배양법 및 박토스캔과 박토카운트 장비간 비교검사를 통하여 신규로 조정한 보정식은 원유검사의 정확성을 향상시키고, 현행 원유 위생등급 제도와 유질 수준을 평가하는데 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 생각된다.

본 연구에서는 2020년 6월부터 2021년 10월까지 국내 목장 집합유를 대상으로 표준검사법인 표준평판배양법과 자동화검사장비(박토스캔FC, 박토카운트IBC)와의 비교검사를 수행하여 보정식에 대한 재평가를 실시하였다. 표준평판배양법에 기초하여 현재의 박토스캔과 박토카운트 보정식은 0.85 이상으로 양호한 상관성을 보였다. 하지만, 세균수 4.0 log unit 이하에서는 SPC 평균값에 비해 상대적으로 장비 측정값이 약간 높게, 세균수 5.0 log unit 이상에서는 SPC 평균값에 비하여 상대적으로 장비 측정값이 약간 낮은 것으로 조사되었다. 이러한 결과를 보완하기 위하여 박토스캔은 세균수 5천 CFU/mL 이하는 1천 CFU/mL까지 측정될 수 있도록 보정계수를 신설하고, 5천∼20만 CFU/mL 구간은 기존과 동일하게, 20만∼100만 CFU/mL 구간은 변경하고, 100만 CFU/mL 이상은 삭제하였다. 박토카운트의 경우에는 표준평판배양법 값에 기초하여 세균수 4.0∼6.0 log unit 구간에서 0.7∼0.8 log unit 값을 올리기 위하여 현행 변환방정식인 Log10*1.18005(IBC)−0.955679를 Log10*1.18005(IBC)−0.875679으로 편차를 조정하였다. 그 결과 박토스캔과 박토카운트 두 장비간 상관성(R2)에 있어서 0.8599에서 0.9134으로 높아졌다. 이러한 결과에 비추어 볼 때 본 연구에서 신규로 조정한 박토스캔과 박토카운트의 보정식은 현행 원유 위생등급 제도와 유질 수준을 평가하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

원유 세균수 검사 시료 제공에 도움을 주신 경북동물위생시험소 본소 관계자분들에게 감사드린다. 본 연구는 2020년 농림축산검역본부의 농림축산검역검사기술개발사업(원유 세균수 검사장비 표준화에 관한 연구, N-1543081-2020-21-02)의 연구비 지원에 의해 수행되었다.

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

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Article

Original Article

Korean J. Vet. Serv. 2022; 45(1): 39-45

Published online March 30, 2022 https://doi.org/10.7853/kjvs.2022.45.1.39

Copyright © The Korean Socitety of Veterinary Service.

국내 원유 세균수 검사장비 박토스캔 및 박토카운트의 보정식 재평가

김이슬ㆍ김진환ㆍ변영섭ㆍ박다솜ㆍ김하영ㆍ윤순식ㆍ문진산*

농림축산검역본부 세균질병과

Received: January 12, 2022; Revised: March 4, 2022; Accepted: March 17, 2022

Re-evaluation on conversion system of BactoScan and BactoCount for raw milk in South Korea

ESeul Kim , Jin-Hwan Kim , Yeong-Seob Byun , Dasom Park , Ha-Young Kim , Soon-Seek Yoon , Jin-San Moon *

Bacterial Disease Division, Animal and Plant Quarantine Agency, Gimcheon 39660, Korea

Correspondence to:Jin-San Moon
E-mail: moonjs727@korea.kr
https://orcid.org/0000-0003-1057-9450

Received: January 12, 2022; Revised: March 4, 2022; Accepted: March 17, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0). which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

The total bacteria count is significantly important factor for hygienic quality in raw milk. BactoScan FMTM and BactoCount IBCTM are the automated instruments for the determination of the total bacterial count in raw milk. They have been used after calibration by standard plate count (SPC) method in South Korea since 2000. It is necessary to re-evaluate for total bacterial counter according to the improvement of milk quality and the change of milk quality grade. Therefore, this study was evaluated the conversion mode of the two machines by SPC method. We collected 921 bulk-tank milk samples throughout the concentration range of 1,000∼1,000,000 CFU/mL from June 2020 to October 2021. As a result, when compared by the SPC value, there was a slight difference in total bacterial count in BactoScan below 10,000 CFU/mL and above 200,000 CFU/mL and in BactoCount above 100,000 CFU/mL, respectively. Therefore, the conversion factor for BactoScan and the conversion equation for BactoCount were newly adjusted based on SPC value, and then the correlation coefficients (R2) was 0.85 or higher. In addition, the correlation (R2) between BactoScan and BactoCount was 0.91, which means the results were high positive correlation. These results are expected to contribute to improving the accuracy of the automated instruments for determining of total bacterial count in raw milk.

Keywords: BactoCount, BactoScan, Conversion system, Raw milk, Total bacterial count

서 론

젖소 원유의 미생물 오염은 유제품에 부정적인 영향을 미치게 되므로 원유의 일반세균수(total bacterial count) 검사는 우유의 생산과 저장과정 중의 위생 및 유질 상태를 평가하는 국제적인 지표로 널리 활용되고 있다(Desmeasures와 Gueguen, 1997). 우리나라에서는 1993년 6월 1일부터 고품질 원유생산을 위해 세균수에 의한 유대차등지급제를 실시해왔다. 그 후 원유의 위생 수준을 높이기 위하여 2016년에는 5개의 위생등급(1A, 1B, 2, 3, 4등급)으로 구분하여 현재까지 사용하고 있다. 이러한 제도 시행으로 인해 원유의 위생 수준이 지속적으로 향상되어 2020년에는 전체 원유의 99.41%가 세균수 1등급(10만 CFU/mL)을 나타내었다. 이에 비하여 3등급 이상(25만 CFU/ml)은 0.12%를 나타내었다(Kang 등, 2020; 농림축산검역본부, 2021).

세균 집락을 측정하는 방법인 표준평판배양법(standard plate count Method; SPC)은 전 세계적인 표준방법으로 이용되고 있다. 하지만 이 검사법은 검사 후 72시간이 경과한 후에야 결과를 알 수 있고, 많은 노동력이 필요하여 다량의 시료를 검사하는데 어려움이 있다(Bolzoli 등, 2017). 세균을 직접 계수하는 직접 현미경법은 15분 정도면 검사 결과를 얻을 수 있으므로 표준평판배양법에 비하면 신속하다. 하지만 생균과 사균을 모두 계수한 결과이며, 아주 적은 양의 시료를 취해야 하므로 실험 결과의 반복성이 떨어지고, 다량의 원유 중 세균수를 검사하기 어려워 원유의 미생물수를 측정하기 위한 일반적인 방법으로는 한계가 있다(농림축산검역본부, 2019).

박토스캔(BactoScan) 및 박토카운트(BactoCount) 등의 검사장비는 원유의 미생물을 형광 물질로 염색하여 형광현미경을 통해 연속적으로 세균을 세는 자동화된 미생물 계수장치이다. 이러한 세균수 검사장비는 검사 시작 후 신속하게 검사 결과를 알 수 있으므로 다량의 시료를 검사하는 데 많이 사용하나, 장비가 비싸고 생균과 사균이 동시에 측정된다는 단점이 있다(ISO, 2003; ISO, 2013; Walter와 Thomas, 2016; Bolzoli 등, 2017; Madden 등, 2017). 그러므로 이러한 장비들은 생균만을 측정하기 위하여 표준평판배양법에 기초하여 국가별 원유 세균수 위생등급 및 유질 수준을 고려한 보정식(coversion system)을 설정한 후 사용하고 있다(Cunningham 등, 1988; IDF, 1998; Gunasekera 등, 2000; Suhren과 Walte, 2000; Gunasekera 등, 2003; ISO, 2003, IDF, 2004; ISO/IDF, 2013; Madden 등, 2017).

우리나라에서도 국내 세균수 검사의 표준검사법인 표준평판배양법에 기초하여 박토스캔은 1993년과 2000년에 유대 지급 등급에 맞게 최소 200개 이상의 냉각기 집합유를 활용하여 15개의 세균수 구간(5천∼2백만 CFU/mL)에 대한 보정계수(conversion factor)를 설정하여 현재까지 사용하고 있다(농림축산검역본부, 2020). 박토카운트IBC의 경우에는 2019년에 국내 일부 원유검사실시기관, 집유장, 유가공장 등에 도입된 후 박토스캔FC 검사법에 기초하여 변환방정식(conversion equation)을 마련하여 유대지불 및 원유 품질 검사에 활용하고 있다(농림축산검역본부, 2021).

국내산 원유의 세균수 수준이 과거보다 향상되었고, 국내 위생 등급(3만∼50만 CFU/mL)의 변화에 따라 세균수 검사장비의 정확성을 향상시키기 위한 보정계수 또는 변환방정식에 대한 재평가가 필요한 실정이다. 이에 본 연구에서는 2020년부터 2021년까지 2년 동안 국내 목장 집합유를 대상으로 표준평판배양법과 박토스캔FC 및 박토카운트IBC 자동화장비와의 비교검사를 실시하여 보정식에 대한 평가를 수행하였다.

재료 및 방법

시료 및 실험설계

2020년 6월부터 2021년 10월까지 총 23회에 걸쳐 국내 세균수 위생등급 수준을 고려한 유대지불 세균수 검사를 위하여 경북동물위생시험소에 제공된 목장 집합유 1,200개 시료를 본 실험에 사용하였다. 경북동물위생시험소에서 박토스캔FC로 일차 검사를 완료한 시료 중 세균수 1천∼100만 CFU/mL의 시료들이 골고루 분포되도록 일일 50∼100개 정도의 시료를 선별한 후 농림축산검역본부 원유검사실에 냉장상태로 신속하게 운송하여 3가지 검사법으로 각각 1회씩 세균수 검사를 실시하였다. 2020년에는 표준평판배양법에 기초하여 박토스캔과 박토카운트의 현재 보정식에 대한 평가를 실시하기 위하여 600여개의 시료를 사용하였고 2021년에는 새롭게 설정한 보정식에 대한 검증 차원에서 600여개의 시료를 박토스캔과 박토카운트로 세균수 검사를 실시하였다.

세균수 검사

표준평판배양법 (Standard plate count)

원유 중 일반세균수 검사는 IDF Standard 100B(1991)에 기초하여 표준평판배양법으로 실시하였다. 즉, 채취한 원유 시료액 1 mL과 희석액(멸균생리식염수) 9 mL을 혼합한 후 10진 희석하여 각 단계 희석액(10−2, 10−3, 10−4)을 멸균 페트리디쉬 2매에 1 mL씩 무균적으로 주입하였다. 그 후 45℃로 유지한 표준한천평판배지 15 mL를 무균적으로 분주하고 천천히 회전하여 좌우로 기울이면서 시료와 배지를 잘 섞어 응고시킨다. 확산 집락의 발생을 억제하기 위하여 다시 표준한천배지 3∼5 mL를 가하여 중첩시킨 다음 응고시킨 페트리디쉬는 거꾸로 뒤집어 30℃에서 72시간 배양하였다. 배양 후 확산 집락이 없고 1개의 평판 당 15∼300개의 집락을 생성한 평판의 집락수를 계산하여 세균수를 측정하였다.

자동화장비(박토스캔 및 박토카운트)

박토스캔(BactoScan FC™, Fhoss Electric A/S Hillerod, Denmark)과 박토카운트(BactoCount IBC™, Bentley Instruments Inc., Chaska, USA)는 농림축산검역본부 세균질병과에 보유 중인 장비를 사용하여 제조회사에서 권장하는 방법대로 원유 중 세균수 검사를 실시하였다. 검사장비가 적정 운용 상태인지를 매 검사시마다 평가하기 위하여 농림축산검역본부 세균질병과에서 제조한 정도관리용 표준시료 3종(low 4만, medium 8만, high 16만 CFU/mL)을 매회 사용하여(Kang 등, 2020), 장비 내 허용오차 범위에 있는지를 확인한 후 원유 중 세균수 검사를 실시하였다.

통계 분석

표준평판배양법, 박토스캔, 박토카운트 장비를 이용하여 세균수를 CFU/mL 단위로 측정한 후 그 결과를 log 값으로 변환하였다. 보정계수 및 변환방정식 평가시 정확성을 높이기 위하여 3가지 결과값 중 1개 이상의 결과에서 0.4 log unit 이상의 차이를 보인 시료는 자료 분석시 제외하였다. 이러한 통계 분석에 사용된 시료수는 총 921개였으며, 측정된 세균수 구간별 시료수는 Table 1에서와 같이 10,000 CFU/mL 미만이 477개로서 전체의 51.8%로 가장 많았고 100,000 CFU/mL 초과가 97개(10.5%)로서 가장 적은 비율을 차지하였다. 이러한 세균수 측정 결과를 엑셀프로그램(Excel plus 2019; Microsoft Corp., Redmond, WA)을 활용하여 세균수 구간(3.0∼6.0 log unit CFU/mL)별로 일치도를 분석하였고 표준평판배양법과 자동화검사법간의 회귀분석 및 상관성을 분석하였다.

Table 1 . Distribution of raw milk samples used in this study by BactoScan FC method.

Range of total bacterial count (CFU/mL)No. of samples (%)
<10,000477 (51.8)
10,000∼50,000272 (29.5)
50,000∼100,00075 (8.1)
>100,00097 (10.5)
Total921 (100)

결 과

표준평판배양법에 기초하여 박토스캔과 박토카운트의 현행 보정식에 대한 평가를 위하여 473개 시료에 대하여 세균수 구간별 일치도와 상관성을 분석하였다. 그 결과 표준평판배양법과 장비간 상관성(R2)에 있어서는 모두 0.85 이상으로 전체적으로 양호한 수준을 보였다. 하지만 Fig. 1에서와 같이 세균수 4.0 log unit 이하에서는 SPC 평균값에 비해 상대적으로 장비 측정값이 약간 높게, 세균수 5.0 log unit 이상에서는 SPC 평균값에 비하여 상대적으로 장비 측정값이 약간 낮게(0.07∼0.08 log unit) 형성되는 것으로 나타났다. 그리하여 SPC 세균수 평균값에 기초하여 Table 2에서와 같이 박토스캔의 경우에는 5천 CFU/mL 이하의 경우에는 1천 CFU/mL까지 측정될 수 있도록 보정계수를 추가로 신설하고, 5천∼20만 CFU/mL 구간은 기존과 동일하게, 20만∼100만 CFU/mL 구간은 변경하고, 100만 CFU/mL 이상의 구간은 삭제하였다.

Table 2 . Comparison of before and after adjustment of conversion factor in BactoScan FC.

Section of bacterial countConversion factorRemark

CurrentNew


IBC*/mLCFU/mLIBC/mLCFU/mL
1--3,0001,000Foundation
222,0005,00022,0005,000Maintenance
337,0009,00037,0009,000
457,00020,00057,00020,000
574,00031,00074,00031,000
6103,00044,000103,00044,000
7149,00065,000149,00065,000
8184,00086,000184,00086,000
9235,000120,000235,000120,000
10372,000201,000372,000201,000
11548,000300,000548,000266,000Adjustment
12861,000429,000861,000365,000
131,402,000586,0001,477,000631,000
142,305,000866,0002,141,0001,018,000
154,318,0001,373,000--Delete
1612,963,0002,000,000--

*IBC: individual bacterial counts, CFU: colony-forming units..


Figure 1. Comparison of trend of total bacterial count before (current) and after (new) the adjustment of conversion system of BactoScan FC and BactoCount IBC based on SPC (Standard plate count) method.

박토카운트의 경우에는 SPC 평균값에 기초하여 세균수 4.0∼6.0 log unit 구간에서 0.07∼0.08 log unit 값을 올리기 위하여 현행 변환방정식인 Log10*1.18005(IBC)−0.955679에서 Log10*1.18005(IBC)−0.875679으로 편차(bias) 값을 약간 조정하였다(Fig. 2). 보정식을 조정한 후 표준평판배양법과 장비간(박토스캔/박토카운트) 일치도와 상관성에서도 각각 0.8595, 0.8610으로 모두 0.85 이상으로 나타나 매우 양호한 수준을 보였다. 또한 4.0 log unit 이하와 5.0 log unit 이상의 세균수 구간의 일치율도 높아졌으며(Fig. 1), 박토스캔과 박토카운트 두 장비간 상관성(R2)은 변경 전(0.8599)에 비하여 변경 후 0.9134로 높아진 것으로 나타났다(Fig. 3).

Figure 2. Adjustment of conversion equation (IBC→CFU) in BactoCount IBC <current; Log10*1.18005(IBC)−0.955679→new; Log10* 1.18005(IBC)−0.875679>.
Figure 3. Comparison of regression between automatic bacterial counters and SPC method before (current) and after (new) the adjustment of conversion system of BactoScan FC and BactoCount IBC.

고 찰

일반세균수는 시료 중에 존재하는 세균 중 표준한천배지 내에서 발육할 수 있는 중온균의 수를 말한다. 원유 중의 일반세균수 검사는 30±1℃에서 약 72시간 배양한 후 세균, 효모, 곰팡이 집락을 계수하여 측정하며 원유의 미생물학적 품질의 지표로서 전세계적으로 활용되고 있다(Regulation EC, 2004). 원유의 일반세균수 검사에 있어서 flow cytometry 기법에 기초한 박토스캔과 박토카운트 자동화 장비 또한 전세계적으로 유대지불 원유검사에 널리 활용되고 있다. 이러한 장비들은 각국의 세균수 위생등급 기준을 고려하여 목장 집합유를 이용해 일반세균수의 표준검사법인 표준평판배양법으로 보정된 후 사용되고 있다(ISO, 2013; Walter와 Thomas, 2016; Bolzoli 등, 2017; Madden 등, 2017).

영국, 이탈리아 등 유럽연합에서는 박토스캔 또는 박토카운트 장비에 대한 보정식 설정 후 위생등급 및 유질의 변화에 따라서 주기적으로 보완하여 사용하고 있다. 즉, 박토스캔의 경우에 3.8천∼49만 CFU/mL 구간에 15개의 보정계수를, 독일에서는 1만∼78만 CFU/mL 구간에 16개의 보정계수를, 스위스에서는 3천∼70만 CFU/mL 구간에 15개의 보정계수를 각각 설정하여 세균수 유대지불 검사에 활용하고 있다. 박토카운트의 경우에는 미국, 유럽, 일본, 브라질 등 14개 국가에서 공동으로 10년 동안 9,500개 시료를 활용하여 변환방정식을 설정한 후 세균수 검사에 활용하고 있다(ISO, 2003; ISO/IDF, 2004; Bolzoli 등, 2017; 농림축산검역본부, 2020).

국내의 경우에도 1993년 위생등급제가 시행된 후 박토스캔 8000 장비가 도입되어 표준평판배양법에 기초한 보정계수가 설정되어 원유검사에 사용되었다. 박토스캔 FC 장비가 2000년에 도입된 후에 박토스캔 8000 장비에 기초하여 설정된 보정계수가 현재까지 그대로 사용되고 있다. 국내산 원유의 세균수가 지속적으로 개선되고, 소비자의 고품질 우유 생산에 대한 요구로 1996년에는 4등급의 기준이 100만 CFU/mL 초과에서 50만 CFU/mL 초과로 변경되었다. 2010년에는 전체 생산된 원유의 0.1%가 50만 CFU/mL 이상을 나타냈으나, 2020년에는 전체 생산된 원유의 0.03%가 50만 CFU/mL 이상이었으며, 99.41%가 10만 CFU/mL 미만으로 생산되고 있다(농림축산검역본부, 2021). 일부 유업체에서는 세균수 최고 기준을 1만 CFU/mL 미만으로 적용하여 프리미엄 우유를 생산하고 있다. 이러한 유질개선 및 낙농산업 여건의 변화로 원유 세균수 검사장비의 보정계수 또는 변환방정식에 대한 재평가가 필요한 실정이다.

이에 본 연구에서는 국내 목장 집합유를 사용하여 표준평판배양법과 박토스캔FC 및 박토카운트IBC 장비 측정값과 비교검사를 실시한 바, 표준평판배양법과 장비간 상관성에 있어서는 모두 0.85 이상으로 양호한 수준을 보였다. 하지만, 세균수 4.0 log unit 이하에서는 SPC 평균값에 비해 상대적으로 장비 측정값이 0.07 log unit 이하의 범위에서 약간 높게 나타났다. 이에 비하여 세균수 5.0 log unit 이상에서는 SPC 평균값에 비하여 상대적으로 장비 측정값이 0.08 log unit 이하의 범위에서 전반적으로 낮게 나타났다. 이러한 결과는 세균수 검사장비의 반복성과 재현성의 권장기준(ISO 16140)이 각각 0.09 log 미만과 0.16 log 미만인 것을 고려할 때 두 장비간 세균수 차이는 매우 양호한 것으로 조사되었다(ISO, 2003). 하지만 국내 유대지불 기준인 4.0∼6.0 log unit 구간에서 박토스캔과 박토카운트 장비간 일치도를 더욱 높이기 위해서는 현행 보정계수 및 변환방정식에 있어서 1만 미만과 20만 이상의 세균수 범위에서 약간의 조정이 필요한 것으로 분석되었다.

따라서 본 연구에서는 이러한 목표 달성을 위하여 박토스캔의 경우에는 세균수 5천 CFU/mL 이하의 경우에는 1천 CFU/mL까지 측정될 수 있도록 보정계수를 추가로 신설하고, 20만∼100만 CFU/mL 구간은 변경하였다. 박토카운트의 경우에는 SPC 평균값에 기초하여 세균수 4.0∼6.0 log unit 구간에서 0.07∼0.08 log unit 값을 올리기 위하여 현행 변환방정식인 Log10*1.18005(IBC)−0.955679을 Log10*1.18005(IBC)−0.875679으로 편차를 약간 조정하였다. 그 결과 현행 보정식의 개선이 필요했던 4.0 log unit 이하와 5.0 log unit 이상의 세균수 구간에서 SPC 평균값과 박토스캔 및 박토카운트 측정값에 있어서 매우 일치한 결과를 확인할 수 있었다. 또한, 원유검사실시기관 및 유업체 등에서 실질적으로 사용하고 있는 박토스캔과 박토카운트 두 장비간 상관성(R2)에 있어서 변경 전(0.8599)에 비하여 변경 후 0.9134로 약간 높아진 것으로 확인 되었으며, 이러한 결과는 ISO의 권장기준인 0.80 이상을 만족한 것으로 평가되었다(ISO, 2003). 위의 연구결과를 종합해 볼 때 본 연구에서 2020년부터 2021년까지의 국내 집합유를 사용하여 표준평판배양법 및 박토스캔과 박토카운트 장비간 비교검사를 통하여 신규로 조정한 보정식은 원유검사의 정확성을 향상시키고, 현행 원유 위생등급 제도와 유질 수준을 평가하는데 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 생각된다.

결 론

본 연구에서는 2020년 6월부터 2021년 10월까지 국내 목장 집합유를 대상으로 표준검사법인 표준평판배양법과 자동화검사장비(박토스캔FC, 박토카운트IBC)와의 비교검사를 수행하여 보정식에 대한 재평가를 실시하였다. 표준평판배양법에 기초하여 현재의 박토스캔과 박토카운트 보정식은 0.85 이상으로 양호한 상관성을 보였다. 하지만, 세균수 4.0 log unit 이하에서는 SPC 평균값에 비해 상대적으로 장비 측정값이 약간 높게, 세균수 5.0 log unit 이상에서는 SPC 평균값에 비하여 상대적으로 장비 측정값이 약간 낮은 것으로 조사되었다. 이러한 결과를 보완하기 위하여 박토스캔은 세균수 5천 CFU/mL 이하는 1천 CFU/mL까지 측정될 수 있도록 보정계수를 신설하고, 5천∼20만 CFU/mL 구간은 기존과 동일하게, 20만∼100만 CFU/mL 구간은 변경하고, 100만 CFU/mL 이상은 삭제하였다. 박토카운트의 경우에는 표준평판배양법 값에 기초하여 세균수 4.0∼6.0 log unit 구간에서 0.7∼0.8 log unit 값을 올리기 위하여 현행 변환방정식인 Log10*1.18005(IBC)−0.955679를 Log10*1.18005(IBC)−0.875679으로 편차를 조정하였다. 그 결과 박토스캔과 박토카운트 두 장비간 상관성(R2)에 있어서 0.8599에서 0.9134으로 높아졌다. 이러한 결과에 비추어 볼 때 본 연구에서 신규로 조정한 박토스캔과 박토카운트의 보정식은 현행 원유 위생등급 제도와 유질 수준을 평가하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

감사의 글

원유 세균수 검사 시료 제공에 도움을 주신 경북동물위생시험소 본소 관계자분들에게 감사드린다. 본 연구는 2020년 농림축산검역본부의 농림축산검역검사기술개발사업(원유 세균수 검사장비 표준화에 관한 연구, N-1543081-2020-21-02)의 연구비 지원에 의해 수행되었다.

CONFLICT OF INTEREST

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Fig 1.

Figure 1.Comparison of trend of total bacterial count before (current) and after (new) the adjustment of conversion system of BactoScan FC and BactoCount IBC based on SPC (Standard plate count) method.
Korean Journal of Veterinary Service 2022; 45: 39-45https://doi.org/10.7853/kjvs.2022.45.1.39

Fig 2.

Figure 2.Adjustment of conversion equation (IBC→CFU) in BactoCount IBC <current; Log10*1.18005(IBC)−0.955679→new; Log10* 1.18005(IBC)−0.875679>.
Korean Journal of Veterinary Service 2022; 45: 39-45https://doi.org/10.7853/kjvs.2022.45.1.39

Fig 3.

Figure 3.Comparison of regression between automatic bacterial counters and SPC method before (current) and after (new) the adjustment of conversion system of BactoScan FC and BactoCount IBC.
Korean Journal of Veterinary Service 2022; 45: 39-45https://doi.org/10.7853/kjvs.2022.45.1.39

Table 1 . Distribution of raw milk samples used in this study by BactoScan FC method.

Range of total bacterial count (CFU/mL)No. of samples (%)
<10,000477 (51.8)
10,000∼50,000272 (29.5)
50,000∼100,00075 (8.1)
>100,00097 (10.5)
Total921 (100)

Table 2 . Comparison of before and after adjustment of conversion factor in BactoScan FC.

Section of bacterial countConversion factorRemark

CurrentNew


IBC*/mLCFU/mLIBC/mLCFU/mL
1--3,0001,000Foundation
222,0005,00022,0005,000Maintenance
337,0009,00037,0009,000
457,00020,00057,00020,000
574,00031,00074,00031,000
6103,00044,000103,00044,000
7149,00065,000149,00065,000
8184,00086,000184,00086,000
9235,000120,000235,000120,000
10372,000201,000372,000201,000
11548,000300,000548,000266,000Adjustment
12861,000429,000861,000365,000
131,402,000586,0001,477,000631,000
142,305,000866,0002,141,0001,018,000
154,318,0001,373,000--Delete
1612,963,0002,000,000--

*IBC: individual bacterial counts, CFU: colony-forming units..


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KJVS
Dec 30, 2022 Vol.45 No.4, pp. 249~342

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eISSN 2287-7630
pISSN 1225-6552
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