Korean Journal of
Veterinary Service

최근 전 세계적으로 구제역, 고병원성 조류인플루엔자, 아프리카 돼지열병 등의 국가 재난형 동물 전염병이 발생하고 있으며 국내에서도 이들 가축 전염병의 발생으로 직접적으로 농가의 피해와 함께 국가 방역 정책 시행에 있어 큰 부담으로 작용하고 있다(Animal and Plant Quarantine Agency, 2022). 현재 국내 가축전염병예방법에서 관리하고 있는 질병으로 소는 구제역, 우역, 우폐역, 결핵병, 브루셀라증, 조류는 고병원성 조류인플루엔자 등이 해당되며 발생시 질병별 긴급행동지침(SOP)에 따라 발생 농장 및 주변 농장을 대상으로 살처분을 하게 되어있다(Ministry of Agriculture, Forestry and Rural Affairs, 2022). 살처분 후 가축 사체의 처리 방식으로는 소각과 매몰 방식 중 주로 매몰 방식으로 진행하나 최근 매몰지의 포화, 환경오염 등의 이유로 새로운 대응 방안을 찾고 있는 실정이다(Cho, 2012; Cho와 Kim, 2012; Kim 등, 2016; Cho, 2020). 이 과정에서 최근 개정된 가축전염병예방법 제22조 제2항은 “가축전염병에 걸렸거나 걸렸다고 믿을 만한 역학조사ㆍ정밀검사 결과나 임상증상이 있는 가축 사체의 소유자 등이나 가축을 살처분한 가축방역관은 농림축산식품부령으로 정하는 바에 따라 지체 없이 해당 사체를 소각하거나 매몰 또는 화학적 처리를 하여야 한다.”라고 규정하여 가축 사체의 화학적 처리를 살처분 방법 중 하나로 추가하여 기존의 매몰 방식의 대안으로 활용할 수 있게 하였다. 그러나 소와 조류 사체의 화학적 처리 방법에 대한 병원체 사멸 조건을 포함한 세부 지침이 없어 현장에서 이를 적용하는데 어려움이 있다. 따라서 본 연구에서는 국내 가축 사체의 처리방식인 화학적 처리방법(알칼리 가수분해)의 활용을 위해 소의 주요 병원체[foot and mouth disease virus (FMDV), bovine viral diarrhea virus (BVDV), Mycobacterium bovis, M. avium subsp. paratuberculosis, Brucella abortus, Bacillus anthracis, Clostridium chauvoei, Cl. perfringens, Escherichia coli, Salmonella Typhimurium]를 포함한 소 사체 및 조류의 주요 병원체[low pathogenic avian influenza virus (LPAIV), Cl. perfringens, E. coli, Salmonella Typhimurium]를 포함한 닭 사체를 화학적 처리 방법에서의 병원체 사멸 조건을 검증함으로써 화학적 처리 방법의 과학적 근거를 마련하고, 살처분 가축 사체의 처리방법을 다양화하는데 기여하고자 하였다.

대상 병원체

본 연구에서 소 사체 처리를 위해 사용한 병원체는 FMDV (FMDV O1 Campos strain, 6PD₅₀), BVDV-1a (1×10⁶ TCID50/mL), M. bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) strain (1×10⁴ CFU/mL), M. avium subsp. paratuberculosis (1×10⁵ CFU/mL), B. abortus (1×10⁵ CFU/mL), B. anthracis (Sterne strain) (1×10⁸ CFU/mL), Cl. chauvoei (2×10⁷ CFU/mL), Cl. perfringens type C (field isolate, 1×10⁶ CFU/mL), E. coli (1×10⁶ CFU/mL), Salmonella Typhimurium (1×10⁶ CFU/mL)를 배양하여 준비하였다. 한편 닭 사체 처리를 위해서는 LPAIV (AIV subtype H9N2 [A/Korean native chicken/Korea/K040110/2010 (H9N2)], 106EID₅₀/mL), Cl. perfringens type C (field isolate, 1×10⁶ CFU/mL), E. coli (1×10⁶ CFU/mL), Salmonella Typhimurium (1×10⁶ CFU/mL) 병원체를 배양하여 사용하였다.

소와 닭 사체의 화학적 처리

폐사 송아지 사체(10일령, 45 kg)를 화학적 처리 반응기에 넣고 사체에 FMDV, BVDV, M. bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) strain, B. abortus, Cl. chauvoei, Cl. perfringens type C, E. coli, Salmonella Typhimurium을 접종하였다(Fig. 1A, 1B). 화학적 처리 반응기에 KOH 액상용액을 송아지 사체 무게의 15%만큼 주입한 뒤 덮개를 덮어 완전히 밀봉 후 90℃에서 5시간 동안 처리하였다(Fig. 1C, 1D).

Figure 1. Process of chemical treatment of cattle carcass including infectious pathogens. (A) Alkaline hydrolysis apparatus of cattle carcass with infectious pathogens, (B) Cattle carcass for chemical treatment process, (C) Potassium hydroxide (KOH) solution mixing for cattle carcass treatment, (D) Treatment condition of alkaline hydrolysis, (E) Residual reaction solution after alkaline hydrolysis of cattle carcass, (F) Residual bone material after alkaline hydrolysis of cattle carcass.

닭 사체(산란계, 20마리, 40 kg)를 반응기에 넣고 사체에 LPAIV, Cl. perfringens type C, E. coli, Salmonella Typhimurium을 접종하였다(Fig. 2A, 2B). 반응기에 KOH 액상용액을 닭 사체 무게의 15%만큼 주입한 뒤 덮개를 덮어 완전히 밀봉 후 90℃에서 5시간 동안 처리하였다(Fig. 2C, 2D).

Figure 2. Process of chemical treatment of chicken carcasses including infectious pathogens. (A) Alkaline hydrolysis apparatus of chicken carcasses with infectious pathogens, (B) Chicken carcasses for chemical treatment process, (C) Potassium hydroxide (KOH) solution mixing for chicken carcass treatment, (D) Treatment condition of alkaline hydrolysis, (E) Residual reaction solution after alkaline hydrolysis of chicken carcasses, (F) Residual bone material after alkaline hydrolysis of chicken carcasses.

소와 닭 사체 화학적 처리 잔존물에서의 병원체 검사

소 사체의 화학적 처리 반응물에서의 병원체 검사를 위해 유전자 검출과 배양 검사를 수행하였다. 대상 바이러스와 세균의 핵산 추출은 각각 QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, USA)와 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, USA)를 이용하였고 추출한 유전자는 5 μL PCR 검사에 사용하였다. PCR 검사 방법으로 FMDV real-time qRT-PCR은 VDx FMDV Real-Time PCR kit (MedianDiagnostics, Korea), BVDV real-time qRT-PCR은 VDx^®BVDV qRT-PCR (MedianDiagnostics, Korea)를 각각 이용하였고 분석방법은 제조사에서 제시하는 방식을 따랐으며, 양성판정은 Ct<40을 기준으로 평가하였다. Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) strain 검출은 dual priming oligonucleotide system을 이용하였다(Shin 등, 2007). 양성 판정은 PCR 후 전기영동을 통해 증폭된 밴드를 확인하였다. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Brucella abortus, Bacillus anthracis 및 Clostridium chauvoei 검출은 동물질병 표준진단요령(Animal and Plant Quarantine Agency, 2017)의 방법을 이용하였다. 양성 판정은 PCR 이후 전기영동을 통해 증폭 밴드 관찰로 평가하였다.

한편 닭 사체의 화학적 처리 반응물에서의 병원체 검사를 위해 유전자 검출과 배양 검사를 수행하였다. 대상 바이러스와 세균의 핵산 추출은 각각 QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, USA)와 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, USA)를 이용하였고 추출한 유전자는 5 μL를 PCR 검사에 사용하였다. LPAIV qRT-PCR은 MegNa Pure 96 System (Roche, Switzerland)을 이용해 RNA 추출하였다. 추출된 RNA는 one-step Probe RT-PCR kit (VDx AIV H9 qRT-PCR kit, MedianDiagnostics, Korea)을 이용하여 real-time PCR (7500 Real Time PCR System, Applied Biosystems)로 증폭하였다. 분석방법은 제조사에서 제시하는 방식을 따랐으며, 양성판정은 Ct<40을 기준으로 평가하였다.

소와 닭에서의 세균 배양으로 Clostridium perfringens 배양은 사체의 화학적 처리 잔존물을 배지(혈액배지, MacConkey배지)에 평판 도말한 후 37℃, 24시간 혐기배양하였다. Dual-hemolytic zone을 보이는 집락을 혈액배지에 계대하고 그람염색을 실시하여 동정하였다. 그람염색결과 염색성이 일치하면 PCR을 실시하여 확인하였다. E. coli 배양은 사체의 화학적 처리 잔존물을 배지(혈액배지, MacConkey배지)에 평판 도말한 후 37℃, 24시간 배양하였다. 혈액배지에서 용혈유무 확인하고, MacConkey agar에서 나타난 핑크색 집락을 EMB agar에 계대(37℃, 24시간)하여 배양 유무를 확인하였다. Salmonella Typhimurium 배양은 사체의 화학적 처리 잔존물을 배지(혈액, MacConkey, XTL4)에 평판 도말한 후 37℃, 24시간 배양하여 MacConkey 배지에서 투명한 집락이나 XLT4에서 중앙부위가 검은색 집락을 채취하여 Chrom agar에 계대(37℃, 24시간)하였다. 분리균을 생화학동정기(VITEK II, USA)를 이용하여 동정하였다.

소와 닭 사체의 화학적 처리 결과

송아지 사체의 화학적 처리 결과는 처리 후 반응기에서 액상의 반응물과 뼈만 확인하였고(Fig. 1E, 1F, 2E, 2F) 이중 액상 반응물은 병원체 존재 여부를 확인하기 위한 검사를 수행하였다. 한편, 닭 사체의 화학적 처리 후 반응기에는 액상의 반응물과 뼈만 남았고(Fig. 2E, 2F) 이중 액상 반응물은 병원체 존재 여부를 확인하기 위한 검사를 수행하였다.

소와 닭 사체의 화학적 처리 잔존물에서의 병원체 검사 결과

소 사체의 화학적 처리 시료를 대상으로 한 FMDV qRT-PCR 결과 FMDV 유전자는 검출되지 않아 불활화 되었음을 확인하였다(Fig. 3A). 또한 BVDV real-time qRT-PCR 결과에서도 BVDV 유전자는 검출되지 않아 불활화 되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 3B). M. bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) strain, M. avium subsp. paratuberculosis, B. abortus, B. anthracis, Cl. chauvoei 검출은 PCR 결과 유전자 특이 증폭 밴드가 관찰되지 않아 대상 병원체 모두 불활화 되었음을 확인하였다(Table 1). 또한 닭 사체의 화학적 처리 잔존물을 대상으로 LPIAV real-time qRT-PCR을 실시한 결과 LPAIV유전자는 검출되지 않았다(Fig. 3C).

Table 1 . Results of real-time PCR, qRT-PCR and culture in cattle and chicken carcasses treated alkaline hydrolysis with Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Brucella abortus, Bacillus anthracis, Clostridium chauvoei, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Salmonella Typhimurium and low pathogenic avian influenza virus.

Animal	Pathogen	Diagnostic methods	Diagnostic results for treated carcass
Cattle	M. bovis	PCR	Negative
	M. avium subsp. paratuberculosis	PCR	Negative
	B. abortus	PCR	Negative
	B. anthracis	PCR	Negative
	Cl. chauvoei	PCR	Negative
	Cl. perfringens	Culture	Negative
	E. coli	Culture	Negative
	Salmonella Typhimurium	Culture	Negative
Chickens	Low pathogenic avian influenza virus	Real-time qRT-PCR	Negative
	Cl. perfringens	Culture	Negative
	E. coli	Culture	Negative
	Salmonella Typhimurium	Culture	Negative

Figure 3. Results of the real-time re­verse transcription polymerase chain reaction assay in cattle and chicken carcasses treated alkaline hydrolysis. (A) Foot-and-mouth disease virus (FMDV); (B) bovine viral diarrhea virus (BVDV); (C) low pathogenic avian influenza virus (LPAIV).

한편 소와 닭 사체에서의 세균 배양 검사 결과 Cl. perfringens는 혈액 배지와 MacConkey배지의 혐기배양 조건에서 Dual-hemolytic zone을 보이는 집락이 관찰되지 않았다. Escherichia coli 배양은 혈액 배지와 MacConkey배지 모두에서 집락이 관찰되지 않았으며 Salmonella Typhimurium은 혈액 배지와 MacConkey배지 및 XLT4 배지 모두에서 집락이 관찰되지 않았다(Table 1).

최근 국내에서는 방역 당국과 축산 농가의 노력에도 불구하고 고병원조류인플루엔자, 아프리카돼지열병, 결핵, 브루셀라병 같은 가축 전염병이 해마다 근절되지 않고 발생으로 인한 살처분으로 농가의 어려움이 지속되고 있는 상황이다. 특히 이들 질병으로 인한 살처분은 초기 매몰 위주의 처리 방식에서 매몰지 확보의 어려움과 매립지의 침출수 유출로 인한 토양, 수질 오염 등의 문제로 인해 친환경적인 사체 처리 기술이 요구 되었다. 이후 이러한 문제를 해결하기 위해 조류 독감 및 구제역이 발생하면 침출수 유출 우려가 적은 밀폐형 용기(FRP) 저장조에 매몰하는 방식이 대안 중 하나로 제시되었으나 FRP 저장조 매몰은 편리성은 있지만 변형의 우려가 있어 지속적인 관리가 필요한 문제점이 있었다(Park 등, 2021). 따라서 최근에는 또 다른 대안으로 랜더링(Rendering) 처리로 전환되고 있는 실정이다. 비매몰 방식인 랜더링은 가축 사체를 고온 고압으로 처리하기 때문에 처리 과정에서 나오는 단백질은 분말과 퇴비 등에 활용하고 지방은 기름과 바이오 디젤 등의 제조에 활용되어 기존 매몰방식의 문제점을 보완하면서 효과적으로 자원을 재활용하기 위한 대안 중 하나로 제시되고 있다(Park 등, 2021).

한편 또 다른 사체 처리방식이 주목을 받고 있는데 가축 사체의 화학적 처리 방식이다.이 방식은 알칼리 가수분해를 이용하여 가축 사체의 구성 성분인 단백질 등이 가수분해(hydrolysis)되면서 아미노산 등의 작은 크기로 분해되는 원리다. 액상으로 분해된 최종 산물에서는 DNA도 검출되지 않을 만큼 분해되어 불활화된다(Kaye 등, 1998; Murphy 등, 2009; Lemire 등, 2016). 또한 알칼리 가수분해 방식은 수산화칼륨(KOH)을 사용하여 처리과정 중 별도의 오염물질이 발생하지 않고, 액상화된 부산물은 토양개량제 등으로 재활용 가치가 큰 장점이 있다. 액상화된 부산물에는 탄소(C), 질소(N), 인(P), 칼륨(K) 함량이 높아 토양에 바로 사용이 가능하며, 높은 아미노산을 포함하고 있어 사료 원료로도 활용 가치가 높다(Gwyther 등, 2011; Seo 등, 2012; Franke-Whittle 등, 2013).

본 연구에서는 소에서의 사체 화학적 처리 과정에서의 병원체 불활화 확인을 위해 10종의 병원체(FMDV, M. bovis, M. avium subsp. paratuberculosis, B. abortus, B. anthracis, Cl. chauvoei, Cl. perfringens, E. coli, Salmonella Typhimurium)를 대상으로 하였고 닭에서의 처리 과정에서는 4종의 병원체(LPAIV, C. perfringens type C, E. coli, Salmonella Typhimurium)를 접종하였다. 이들 병원체를 접종한 사체를 대상으로 KOH 액상용액을 주입한 뒤, 90℃에서 5시간 동안 처리한 결과 모든 사체 성분의 액상화와 함께 접종한 병원체 모두 유전자 검사와 배양검사에서 검출되지 않아 이를 바탕으로 소와 닭 사체에 대한 화학적 처리가 병원체 사멸에 효과적이며 질병 전파의 위험이 없는 안전한 방법임을 증명할 수 있었다. 이 결과는 돼지를 대상으로 한 실험 결과와 동일한 결과를 보여주었다(Oh 등, 2021).

국내에서 가축 사체의 가수분해를 통한 사체 분해율과 액상부산물의 비료학적 가치평가를 통해 최적 가수분해제를 분석한 결과 가축 사체의 농업적 재활용을 위한 최적 가수분해제는 KOH이었다고 보고하였다(Seo 등, 2012). 그러나, 이 알칼리 가수분해 과정에서도 소와 닭에서의 주요 전염병 병원체에 대한 사멸조건 검증 결과는 제시되지 않아 이에 대한 보완이 필요한 상황이었다.

본 연구는 가축사체의 화학적처리 방식이 가축전염병 예방법에 도입이 되어있으나 이를 적용하는데 있어 과학적 자료를 기반으로 한 세부 절차를 마련하는데 목적이 있다. 가축 사체의 화학적 처리 방법이 현재 국내 매몰 중심의 살처분 방식의 대안으로 제시될 수 있으며 환경오염 방지와 공중보건학적 측면에서 기여할 것으로 기대한다.

본 결과물은 농림축산식품부의 재원으로 농림식품기술기획평가원의 축산현안대응산업화기술개발사업의 지원을 받아 연구되었음(과제번호: 321087-5).

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.